一种简易分离和培养人原代支气管上皮细胞方法的构建

发布时间：2020-04-15 18:57

【摘要】：背景从全球范围内来看,近年来,空气污染逐年加重,尤其是雾霾污染,呼吸系统疾病的发病率和死亡率也呈上升趋势~([1]),在中等收入国家,死亡率排名前三的疾病分别是:脑血管疾病(约占死亡人口数的14.4%),缺血性心脏病(约占12.7%),慢性阻塞性肺疾病(约占12.0%)~([2]),尤其是秋冬季节,呼吸系统疾病的发病率和死亡率更高,其中,人体暴露于可吸入肺颗粒物PM2.5的几率大大增加是主要因素。目前,我国已成为全球空气污染最严重的地区,其中,北京、天津、河北、长江三角洲区域、成都、重庆和中原地区是全球范围内污染最严重的地区,PM2.5等年平均空气污染物超过每立方米70微克,超过国家标准的2倍以上,高于WHO指导值的7倍以上。从2009-2012年1月份同期卫星遥感数据来看,1月份灰霾污染的频次、影响范围、影响强度均呈现增加态势,特别是2013年1月份发生的灰霾事件波及了超过130万平方公里的面积,人口有11亿人受到灰霾的严重污染,这在全世界范围内,持续时间长、覆盖面广、污染程度高都属于罕见情况。这对呼吸系统疾病的发生发展机制、病理生理学、药物毒理学等方面的研究和应用提出了新要求~([3])。而人原代支气管上皮细胞是吸入的外源性毒物进入机体后首先分离和培养的研究对于构建体外呼吸道模型起到非常重要的作用,进一步参与呼吸系统疾病的发生发展、炎症机制、药物反应、空气污染的治理、公共卫生等方面的研究和应用。目前已有报道的人原代支气管上皮细胞的分离方法是蛋白酶消化法~([11])和组织贴块法~([10]),使获取的样本组织分散为单个细胞,用于体外研究。本研究通过纤维支气管镜刷检直接获取单个支气管上皮细胞而不需要经过蛋白酶消化和组织贴块法进一步分离,节省实验步骤和时间,并且尽可能多的保留人原代支气管上皮细胞的原有结构,为探索一种高效便捷的人支气管上皮细胞体外培养模型建立基础。目的分离、纯化并优化体外人支气管上皮细胞原代培养方法并进行鉴定,旨在为研究呼吸系统相关疾病和药物毒理学等方面的应用提供良好的研究载体和实验依据。方法(1)呼吸道组织采样:在新乡市某医院支气管镜室内,经被检查者及家属同意,由纤维支气管镜刷检获取相对正常的人支气管强表层组织,进行初采样,确保所获样本细胞较高的接种存活率;(2)原代人支气管上皮细胞的纯化、分离和培养:采用无血清的BEGM培养基进行人支气管上皮细胞的纯化和分离,行原代培养并传代,台盼蓝染色测定细胞存活率;(3)细胞的形态和结构鉴别:通过倒置相差显微镜和免疫荧光染色观察细胞特性并鉴定。(4)细胞功能检测:用人白介素8(IL-8/CXCL8)酶联免疫试剂盒和乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒检测细胞功能。结果(1)经纤维支气管镜刷检可建立一种简单的分离人原代支气管上皮细胞的方法,能够获取较多单个的支气管上皮细胞,不借助消化酶的作用;(2)经纤维支气管镜刷检获取和分离的人原代支气管上皮细胞体外培养存活率可达96.8%;(3用此方法获取的细胞样本,我们用无血清培养基进行原代培养,并收集,用上皮细胞特有标记物角蛋白8单克隆抗体行免疫荧光染色鉴定,证实所培养的原代细胞是人支气管上皮细胞。(4)用不同浓度的可吸入肺颗粒物PM2.5刺激经此种方法获取并在体外进行培养的人原代支气管上皮细胞,并分别检测刺激以后细胞中白介素8和乳酸脱氢酶的水平,证实经纤维支气管镜刷检获取并培养的人原代支气管上皮细胞功能正常。结论(1)经纤维支气管镜刷检获取和分离人支气管上皮细胞,是一种简单易操作、快捷有效的方法;(2)经纤维支气管镜刷检获取的人原代支气管上皮细胞体外培养存活率高,可达96.8%;(3)经纤维支气管镜刷检获取的人原代细胞经免疫荧光染色鉴定被证实为人原代支气管上皮细胞;(4)经纤维支气管镜刷检获取的人原代支气管上皮细胞对大气可吸入肺颗粒物PM2.5刺激敏感,细胞功能正常。
【图文】：

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密0%—80将细胞后，收存细胞镜刷检透明，密集呈铺路0%，见图 1胞经胰蛋白酶收集细胞，离胞。检获得的人呈单个、散路石样分布生10；原代培酶-EDTA 消离心（1500人支气管上皮散在分布（生长，细胞培养第 20 天消化液（0.20 转/分，离皮细胞，原代（x100）胞大小均匀天，细胞生5%）进行离心 5 分钟代培养第
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2

【参考文献】