参与DNA损伤应答lncRNA的鉴定及其功能的初步研究

发布时间：2020-04-16 02:12

【摘要】：在生物体内,维持基因组的稳定性是细胞正常生存的必要条件。然而,有许多外源因素和内源因素会造成DNA的断裂,如细胞代谢产物、UV和电离辐射等。为维持基因组的稳定性,机体进化出了高度保守的应答体系,称之为DNA损伤应答(DNA damage response,DDR)。DNA损伤应答过程包括DNA损伤位点的识别、招募DNA修复复合物到DNA损伤位点、修复受损的DNA、激活细胞周期检验点以及诱发凋亡[1],DNA损伤应答对多个细胞进程都有广泛的影响。为确保足够的时间完成精确有效的DNA损伤修复,细胞周期检验点激活并使细胞周期阻滞。同时,细胞也将激活一些基因的转录,这些基因包括DNA损伤修复和调控细胞周期相关基因。最近研究表明,不仅蛋白编码基因,非编码的基因也在维护基因组稳定性过程中起到重要作用[1-3]。其中长链非编码RNA(long non coding RNA,lnc RNA)是一类由RNA聚合酶Ⅱ产生,长度大于200bp的RNA,它们的表达量低,保守性低,且具有组织特异性。当DNA损伤后,DDR相关lnc RNA会在转录水平、转录后水平以及RNA降解水平被调控。同样的,lnc RNA也可以靶向DDR相关的基因调控其表达。lnc RNA可以作为信号、诱饵、导引、支架调控基因表达。近几年来,虽然已经在lnc RNA维护基因组稳定性方面做过很多研究,识别了许多参与DNA损伤应答的lnc RNA,但lnc RNA如何参与DNA损伤应答以及它们的应答机制仍然是未知的。在来自清华大学高冠军教授实验室的大力支持下,我们获得了43株lnc RNA敲除的果蝇株。为研究参与DNA损伤应答的lnc RNA,我们采用在辐照后统计生存率和染色体断裂数目的方法,对43株lnc RNA敲除果蝇株进行了DNA损伤敏感性的检测,获得了12株具有DNA损伤敏感性的lnc RNA敲除果蝇株,初步认为这12个lnc RNA可能参与DNA损伤应答。为系统性的筛选出更多参与DNA损伤应答的lnc RNA,采用了高通量测序技术,使用野生型w1118果蝇、p53突变果蝇、e2f1突变果蝇的三期幼虫,在生理条件和辐照条件下,获得了242个差异表达的lnc RNA。此外,在43株lnc RNA敲除果蝇株里面,CR43356在RNA测序结果中出现了差异表达。DNA损伤敏感性检测实验表明,CR43356敲除果蝇株对DNA损伤高度敏感。通过查找Fly Base网站信息,发现CR43356主要在果蝇三期幼虫的翅膀胚芽组织中表达。为进一步探究CR43356参与DNA损伤应答的机制,我们对CR43356果蝇进行了G2/M检验点检测和凋亡检测,结果发现CR43356参与DNA损伤应答通路中凋亡调控过程。
【图文】：

果蝇,染色体断裂

31图 1 lncRNA 敲除果蝇 DNA 损伤敏感性检测。A. lncRNA 敲除果蝇生存率曲线。lncRNA 敲除果蝇株在不同辐照剂量处理后，统计其羽化情况，绘图分析。存活数量与w1118相比表现出显著差异的lncRNA，认为相应lncRNA可能参与DNA损伤应答，共 12 株 lncRNA 敲除果蝇株。B.存活数量与 w1118相比无显著差异的 lncRNA，认为相应 lncRNA 不参与 DNA 损伤应答，共 29 株 lncRNA 敲除果蝇株。C. 染色体断裂数目统计图。在 20Gy 辐照处理条件下统计 lncRNA 敲除果蝇株三期幼虫脑组织中染色体断裂数目，使用 t 检验对结果进行统计分析，p＞0.05 认为无统计学显著差异。：p≤0.05; ：p≤0.01; ：p≤0.0001;3.2 参与 DNA 损伤应答相关 lncRNA 的鉴定p53 和 E2f1 作为非常重要的转录因子，它们可以转录调节不同的细胞因子以

流程图,样品提取,测序,结果分析

大连医科大学硕士学位论文 RNA 来参与 DNA 损伤应答，在 DNA 损失修复，，凋亡等生物学进程中十分重要的作用[16, 17]。为进一步筛选出更多参与 DNA 损伤应答且被录调控的的 lncRNA,本课题采用了高通量测序技术使用野生型果蝇果蝇 p535A-1-4，e2f1 突变果蝇株 e2f107172/i2的三期幼虫在生理条件和照处理的条件下，分别提取总 RNA，经质量检测合格后，进行测序馈的 RNA 测序数据进行处理分析，数据分析流程图如图 2 所示：
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R346

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