circ-ZNF609介导的细胞通讯对血管细胞功能的影响及分子机制

发布时间：2020-04-21 02:15

【摘要】：血管系统在维持身体组织的氧和营养供应中发挥着重要作用。血管生成作为正常生理过程遍布人体各个器官,贯穿胚胎和个体发育的各个阶段,并且与心血管疾病、肿瘤病变、类风湿关节炎、糖尿病视网膜病变、伤口愈合等多种病症相关。因此揭示血管新生机制以及血管新生影响因素一直为人们所重视。血管细胞之间以及细胞与环境之间有复杂精细的信息联系,血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)作为血管中膜的主要成分,可以分泌生长因子激活多种信号转导途径,通过调控基因表达使血管发生增殖、凋亡、迁移、炎性反应等多种生物学效应。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类广泛且多样地存在于哺乳动物细胞中、具有调控基因表达作用的内源性RNA分子,是近年来的研究热点之一。然而VSMC是否能够通过circRNA介导的细胞间通讯影响内皮细胞(endothelial cell,EC)生物学行为还不得而知。本研究拟从circRNA入手,探寻circRNA介导的细胞通讯对血管细胞功能的影响及分子机制。第一部分平滑肌源circ-ZNF609抑制内皮VEGFA表达和血管新生目的:本部分研究选择平滑肌细胞特异性Sirt1-Tg小鼠为研究对象,观察Sirt1-Tg鼠和野生型(wild typy,WT)小鼠血管新生的差异。筛选、分析两种小鼠血管组织中差异表达的circRNA,进而在ECs和VSMCs中验证低氧条件下circRNA的表达变化,同时检测ECs中VEGFA的表达变化。方法:1.本部分研究选择平滑肌细胞特异性Sirt1-Tg小鼠为研究对象,将含有或不含血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)的基质胶植入WT和Sirt1-Tg小鼠皮下,免疫荧光染色观察Sirt1-Tg和WT小鼠血管新生的差异。2.实时定量PCR筛选、分析两种小鼠血管组织中差异表达的circRNA,进而在ECs和VSMCs细胞中验证低氧和SIRT1对circRNA的表达影响。同时western blot检测ECs中VEGFA的表达水平变化。结果:1.Sirt1-Tg小鼠血管新生能力减弱。2.提取Sirt1-Tg和WT小鼠血管平滑肌细胞总RNA,筛选差异表达的circRNA,发现circ-ZNF609在VSMCs和ECs中表达量丰富,并且低氧诱导Sirt1-Tg血管平滑肌细胞circ-ZNF609表达并可进入ECs。3.VSMC源circ-ZNF609抑制内皮细胞VEGFA表达。第二部分circ-ZNF609抑制内皮HIF1α核转位和VEGFA的转录激活目的:基于第一部分的发现和前人研究报道,本部分以circ-ZNF609和HIF1α为研究对象,试图从circ-ZNF609与HIF1α的关系入手,寻找circ-ZNF609在血管新生中对VEGFA的具体调控机制。方法:1.敲低和过表达circ-ZNF609后利用Western blot和免疫荧光技术检测HIF1α表达水平和核转位的变化。2.利用RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation assay,RIP)、RNA pull-down和荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)研究RNA-蛋白质互作;用染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,CHIP)确认circ-ZNF609对VEGFA转录调控的影响。结果:1.在EC中敲低circ-ZNF609后,HIF1α由胞浆进入细胞核增多,HIF1α胞浆/胞核转位增强;相反过表达circ-ZNF609抑制HIF1α核转位。2.RIP、RNA pull-down和FISH结果均显示,circ-ZNF609和HIF1α二者相互作用、在胞浆共定位。3.过表达circ-ZNF609后,转录因子HIF1α在VEGFA基因启动子区的富集显著减弱。第三部分结直肠癌细胞circ-ZNF609的表达特征及其对血管平滑肌细胞行为的影响目的:结直肠癌是常见且严重危害健康的消化道肿瘤之一,肿瘤的发生发展离不开肿瘤血管的生成。本部分试图观察血管发生过程中肿瘤细胞对VSMCs行为学特性的影响,并验证circ-ZNF609是否参与上述调控过程。方法:1.通过荧光实时定量PCR检测circ-ZNF609在结直肠癌细胞和培养基中的表达变化。2.用MTT、细胞计数和western blot验证肿瘤条件培养基(tumor conditioned medium,TCM)对VSMC增殖的影响。3.利用Annexin V-FITC/PI、TUNEL和JC-1法检测TCM对平滑肌细胞凋亡的影响。4.免疫组织化学染色验证结直肠癌组织微血管和平滑肌变化,荧光实时定量PCR验证circ-ZNF609在结直肠癌组织中的表达变化。结果:1.结直肠癌细胞和培养基中circ-ZNF609表达水平均较正常肠上皮细胞中下降。2.TCM抑制VSMCs增殖,但并未影响VSMC中PCNA的表达。3.TCM通过诱导VSMCs中Caspase-3活化,Bax/Bcl-2比值增加诱导VSMCs凋亡。4.结直肠癌组织中MVD增加,血管壁VSMC表达减少,同时伴有circ-ZNF609表达下降。结论:1.低氧可诱导Sirt1-Tg-VSMC表达和分泌circ-ZNF609。2.平滑肌源circ-ZNF609可介导平滑肌-内皮细胞通讯,抑制内皮VEGFA表达和血管新生。3.circ-ZNF609与HIF1α相互作用,抑制HIF1α浆/核转位,降低VEGFA转录活性。4.结直肠癌细胞circ-ZNF609表达分泌减少,其条件培养基诱导VSMCs凋亡。
【图文】：

血管新生,小鼠

图 1-1 Sirt1-Tg 小鼠血管新生能力减弱Fig.1-1 The over-expression of SIRT1 impairs angiogenesis in Sirt1-Tg A. Representative image and quantification of CD31-positive vessecryopreserved, sectioned, and immunofluorescently stained Matrigel pfrom WT mice and Sirt1-Tg mice (n=5 mice per group; Scale bar 100μAll data are expressed as mean ±SEM, **P<0.01.

内皮细胞

27图 1-3 VSMC 源 circ-ZNF609 抑制内皮细胞 VEGFA 表达Fig.1-3 VSMC-derived circ-ZNF609 inhibits endothelial cell VEGFAexpressionA. Quantitative PCR and Western blot analysis of VEGFA expression inprimary cultured ECs which were exposed to 21% or 1% O2 for 24 hours.Data are presented as the mean ± SEM, *P<0.05.B. Quantitative PCR and Western blot analysis of VEGFA expression inprimary cultured ECs which were incubated with VSMC media. Data are
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R346

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