干扰素γ增强脂肪间充质干细胞对淋巴细胞免疫调节

发布时间：2020-04-21 21:34

【摘要】：目的掌握自体脂肪间充质干细胞(ADSCs)的提取以及培养方法,观察干扰素γ(IFN-γ)增强成人自体ADSCs对外周血淋巴细胞免疫调节作用及机制。方法本研究方法为收集健康人体的ADSCs,将ADSCs进行培养至第3代,观察细胞形态,对细胞表面分化抗原进行流式细胞鉴定,同时对细胞进行成脂以及成骨细胞分化实验,对ADSCs进行鉴定。收集分离外周血单个核细胞(PBMCs),与ADSCs建立共培养体系共培养5d,在共培养体系中加入植物血凝素(PHA)和白细胞介素(IL-)2来活化T细胞。本研究共分三组,一组为IFN-γ诱导ADSCs的IFN-γ刺激组,一组为没有IFN-γ诱导的未刺激组,一组为IFN-γ诱导ADSCs后又加入1-甲基色氨酸(1-MT)的IDO阻断组。对照组单纯采用PHA和IL-2刺激T细胞。每组与PBMCs按一定的比例共培养,采用MTT法检测T细胞增殖吸光度值,进而计算出T细胞增殖抑制率。使用流式细胞术检测出活化T细胞CD4+CD25+Treg比例。检测IFN-γ对IDO基因以及蛋白水平的变化。结果ADSCs传3代后形态为典型的纺锤形,贴壁生长;分离的自体ADSCs高表达分化群(CD)73、CD90、CD105阳性率均95%,低表达造血干细胞表面标志CD34、CD45,流式细胞术鉴定表面标志物符合国际标准;ADSCs具有分化为成脂和成骨细胞的能力。ADSCs与淋巴细胞比例为1:50时,增殖抑制率为(20.25±3.10)%,比例为1:10时增殖抑制率为(52.75±4.85)%,比例为1:5时增殖抑制率为(65.75±5.12)%,T细胞的增值抑制率和细胞比例呈剂量依赖关系,IFN-γ预刺激组ADSCs与淋巴细胞比例为1:50时,增殖抑制率为(48.00±5.35)%,比例为1:10时增殖抑制率为(70.75±4.19)%,比例为1:5时增殖抑制率为(79.50±6.19)%,T细胞的增值抑制率和细胞比例呈剂量依赖关系,并高于未刺激组;IFN-γ预刺激组CD4~+CD25~+Treg比例为(22.05±2.43)%与未刺激组相比显著升高;IFN-γ预刺激组ADSCs内IDO mRNA表达水平显著高于未刺激组;IFN-γ预刺激组ADSCs内IDO蛋白表达水平显著高于未刺激组;IDO阻断组对活化T细胞增殖抑制率较IFN-γ预刺激组显著降低(P0.01)。结论随ADSCs与T细胞共培养比例增大,ADSCs对活化T细胞增殖的抑制率显著提高,呈剂量依赖关系。进一步利用IFN-γ预处理ADSCs,结果发现IFN-γ刺激显著增强ADSCs负性调节作用。利用IFN-γ预处理ADSCs后ADSCs诱导活化T细胞向CD4~+CD25~+Treg亚群转化的能力增强。PCR实验发现IDO mRNA表达受IFN-γ影响,IFN-γ能促进IDO mRNA表达。在蛋白质水平上,IFN-γ也能促进IDO蛋白表达。使用1-MT后能很大程度上抑制ADSCs介导的免疫抑制。总而言之,IFN-γ促进ADSCs对活化T细胞免疫抑制能力,IDO在ADSCs介导的免疫抑制中起重要免疫调节作用。
【图文】：

外周血单个核细胞,自体,T细胞增殖

图 1.1 外周血单个核细胞分层1.1.3.9 ADSCs 对自体 T 细胞增殖能力的影响噻唑蓝（MTT）比色法是一种检测细胞生长和存活状态的方法，具有快速、简便、灵敏等优点。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以使噻唑蓝还原为不溶于水的蓝紫色结晶并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。对于细胞增殖的检测，当细胞增殖率较高时，由于活细胞数量较多，会导致溶液颜色较深。二甲基亚砜能溶解沉积在细胞中的蓝紫色结晶，通过酶标仪检测波长在 490 nm 处的光密度值，可间接反映活细胞数量。（1）使用传代三代的 ADSCs 进行实验，当 ADSCs 融合至 90%时细胞状态最好，加入 0.5mL 的胰酶对细胞进行消化，使细胞都尽量成为单个细胞，不要粘连，消化结束后加入 5mL 完全培养基将细胞充分吹匀。（2）收集细胞至离心管中，300g 离心 5min，收集细胞沉淀，加入 1mL 完

形态图,形态,多角形

SCs 的细胞形态ADSCs接种于培养瓶24 h后均可见贴壁细胞，呈圆形或多角形，48h后首次换液，细胞贴壁较牢固，4～5d后梭形细胞逐渐样生长，，形成逐渐呈长梭形外观，10 d左右时，细胞集落达到生长，细胞间紧密排列有一定方向感。约16 d左右细胞长满瓶状镜下可见主要呈长梭形，增长趋势稳定，并成几何倍数关DSCs形态比较均为典型的纺锤形，（见图1.2）；ADSCs爬片色后,可见细胞主要呈梭形，也有多角形等形态，胞核染成紫紫色（见图1.3）。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

【参考文献】