【摘要】：目的:构建急性移植物抗宿主病(acute Graft-Versus-Host-Disease,a GVHD)小鼠模型并评价过继性输注雷帕霉素(rapamycin,RAPA)体外诱导的耐受性树突状细胞(dendritic cells,DCs)治疗a GVHD的效果。方法:以BALB/C(H-2Kd)为供体,C57BL/6J(H-2Kb)为受体建立a GVHD小鼠模型(BALB/C→C57BL/6J);以小鼠来源的骨髓细胞经体外培养获得DCs,加入RAPA诱导其为耐受性DCs(RAPA-t DCs);将RAPA-t DCs经尾静脉过继性输注至a GVHD模型小鼠,建立活体荧光成像可观察的DCs体内示踪模型并被研究萤火虫荧光素酶报告基因标记的DCs在a GVHD小鼠体内的迁移、归巢模式;记录各组小鼠的平均体重波动并统计其生存率状况,评价RAPA-t DCs抑制小鼠a GVHD的效果。结果:与PBS对照组比较,RAPA能明显抑制DCs表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHCII表达水平,且使表达DCs表面趋化因子受体CCR1(14.5±1.4 vs.10.0±2.1)、CCR5(12.7±2.3 vs.7.2±1.2)表达下调,而对CCR7(7.8±1.3 vs.6.2±2.5)的表达没有显著影响。成像结果显示,RAPA处理对DCs在体迁移能力无显著影响,RAPA-t DCs仍然具有归巢至淋巴结、脾脏等淋巴组织或器官的能力。最后,与PBS-DCs对照组比较,实验组a GVHD小鼠体重下降趋势明显放缓(-2.4±1.5 vs.-1.9±1.2,P0.05),且其生存期延长(10.1±5.5 vs.16.6±6.7,P0.05),但整体存活率无显著性差异。结论:a GVHD小鼠模型构建成功。RAPA能通过抑制DCs表面共刺激分子的表达从而诱导DCs耐受,过继性输注的RAPA-t DCs仍具有一定的T细胞富集区归巢能力且能够一定程度缓解a GVHD,延长小鼠的生存期,但没有改善其整体存活率。目的:通过研究纳米材料氧化石墨烯(graphene oxide,GO)对小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞(immature dendritic cells,im DCs)共刺激分子、趋化因子受体表达水平及炎症应答能力,探讨GO对im DCs在体迁移及归巢能力的影响并研究其机制,为设计和应用氧化石墨烯-神经肽复合物诱导耐受性DCs治疗a GVHD提供实验数据与理论依据。方法:对三种不同片径GO进行表征,GO体外与小鼠骨髓来源im DCs共孵育48 h,将不影响细胞增殖的最高剂量确定为GO的工作浓度;酶联免疫吸附法(ELISA)检测GO处理im DCs后细胞因子分泌水平;流式细胞术检测DCs共刺激分子、趋化因子受体表达水平和活性氧(ROS)含量;收集GO处理后的im DCs,并经脚垫过继性输注给小鼠,BLI监测细胞迁移速度及归巢模式;细胞免疫荧光法染色并比较各组im DCs微丝和微管的状态和分布。结果:(1)应用透射电子显微镜(TEM)、动态光散射仪(DLS)、Zeta电位测试仪和原子力电镜(AFM)对三种片径尺寸GO纳米材料进行表征,发现三种GO均为单层氧化石墨烯材料,其厚度约1-2 nm,根据其片径尺寸分别将其命名为S(small,约为50-200 nm)、M(medial,约为200-500 nm)和L(large,约为500-1500 nm)。(2)不同片径GO与DCs共孵育体系中细胞存活率均高于90%的最大GO浓度为15.6μg/ml,因此以15.6μg/ml为本研究中GO处理DCs的工作浓度。(3)TEM下观察到GO能在体外被DCs摄取,不同片径GO被DCs内吞的模式有差异。(4)Ctrl-DCs对照组im DCs表面CD40、CD80及CD86的表达丰度分别为(44.27±3.46)%、(32.67±1.70)%及(32.73±1.52)%;S-DCs组表面CD40、CD80及CD86的表达丰度分别为(53.43±0.55)%、(34.93±1.01)%及(43.83±4.01)%;M-DCs组im DCs的共刺激分子CD40、CD80及CD86的表达丰度分别为(54.43±2.48)%、(45.10±4.19)%及(47.97±0.85)%;L-DCs组则为(57.13±2.70)%、(46.93±0.86)%及(49.97±0.76)%,表明GO刺激im DCs后,其表面共刺激分子CD40、CD80以及CD86表达率均较Ctrl-DCs组升高,差异有统计学意义(P0.05)。(5)S-DCs、M-DCs、L-DCs组分泌的IL-6(分别为42617.02±341.24 pg/m L、51709.04±10.78 pg/m L、48080.82±4856.53 pg/m L)均高于Ctrl-DCs组(37361.91±5357.26 pg/m L),S-DCs、M-DCs、L-DCs组分泌的IL-1β(分别为1683.46±74.01 pg/m L、1655.18±24.74 pg/m L、1424.51±95.88 pg/m L均低于Ctrl-DCs组(1958.28±81.75 pg/m L),S-DCs、M-DCs、L-DCs组分泌的TNF-α(分别为75771.43±1924.05 pg/m L、83261.90±1716.77 pg/m L、73084.24±883.93 pg/m L均低于Ctrl-DCs组(81662.73±2249.19 pg/m L),IL-12p70浓度(分别为66.67±2.01 pg/m L、57.54±8.99 pg/m L、64.38±5.97 pg/m L)均低于Ctrl-DCs对照组(80.74±4.11 pg/m L),上述差异均有统计学意义(P0.05)。(6)S-DCs组和L-DCs组CXCR4表达丰度(分别为35.47±1.92、31.48±1.01)%明显高于Ctrl-DCs组(24.94±0.65)%,S-DCs组、M-DCs组和L-DCs组CCR7表达丰度(分别为20.00±2.53、13.04±1.89、14.43±3.71)%明显高于Ctrl-DCs组(10.45±1.89)%,差异有统计学意义(P0.05)。(7)脚垫输注迁移模型中,S-DCs组、L-DCs组、M-DCs组及Ctrl-DCs组DCs在48 h迁移到PLN的百分比分别为(0.17±0.02 vs.0.12±0.06 vs.0.11±0.05 vs.0.07±0.01),72 h迁移到PLN的百分比分别为(0.24±0.05 vs.0.16±0.09 vs.0.15±0.05 vs.0.08±0.02),组间均有统计学差异(P0.05),说明迁移速率顺序为S-DCsL-DCsM-DCsCtrl-DCs。(8)共聚焦显微镜观察结果显示,GO处理过的im DCs细胞延展性更高,细胞间黏附现象较明显,并伸出大量丝状伪足,呈放射状朝四周排列,其中S-DCs组这一现象更为明显。而对照组细胞支架可变性较差,细胞间缺乏黏附。(9)流式细胞仪检测不同片径GO处理DCs体系ROS产生情况:S-DCs、M-DCs、L-DCs组产生的ROS平均荧光强度分别为274.52±13.44,244.51±7.78,243.53±27.58,均高于Ctrl-DCs组(165.51±10.62),差异有统计学意义(P0.05)。结论:采用不同片径GO处理im DCs,其表面共刺激分子CD40、CD80和CD86表达均上调,IL-6分泌明显上调,IL-1β、TNF-α和IL-12p70分泌受到抑制;GO显著上调CXCR4和CCR7的表达;活体成像结果显示,GO处理后DCs自脚垫迁移至乆窝淋巴结的速度相比对照组约提升1.5-3倍,迁移速率最快的是50-200 nm即小尺度GO处理的DCs;共聚焦显微镜下观察到GO处理后DCs微丝、微管重排及黏附现象明显,且能促进共孵育体系中活性氧的产生。由上述实验结果推测,GO促进DCs产生的ROS增强了DCs细胞支架重排和粘附现象,最终提升了DCs迁移及归巢能力。目的:以BALB/C(H-2Kd)为供体,C57BL/6J(H-2Kb)为受体,结合活体成像平台建立可视化a GVHD小鼠模型(BALB/C→C57BL/6J);设计并应用神经肽-氧化石墨烯体外诱导耐受性树突状细胞(tolerogenic dendritic cells,t DCs),经尾静脉过继性输注至a GVHD模型小鼠,评价其抑制小鼠a GVHD的效果。方法:酶联免疫吸附法(ELISA)检测四种神经肽处理im DCs在低剂量LPS刺激下细胞因子分泌水平,筛选出效果更优的神经肽UCN,并将其与GO偶联,监测复合物抑制DCs分泌促炎细胞因子情况,流式细胞术检测体系共刺激分子表达水平;CFSE标记BALB/C小鼠来源的T细胞,按比例与UCN-DCs或Ctrl-DCs混合培养72 h后,流式细胞仪检测T细胞增殖水平;收集各组UCN-GO处理后的im DCs,并经脚垫过继性输注给小鼠,BLI监测体内DCs细胞分布、迁移及归巢模式;将UCN-GO-DCs经尾静脉过继性输注至a GVHD模型小鼠,活体荧光成像观察萤火虫荧光素酶报告基因标记的T细胞在a GVHD小鼠体内增殖情况即a GVHD治疗效果。结果:(1)低剂量LPS刺激下比较四种神经肽抑制DCs分泌促炎细胞因子的能力:UCN-DCs组分泌的促炎类细胞因子IL-12p70(63.55±9.19pg/m L vs.102.92±10.78 pg/m L)、IL-6(2386.76±524.44 pg/m L vs.27370.14±1640.17 pg/m L)、IL-1β(1248.70±34.33 pg/m L vs.1574.46±37.39 pg/m L)、TNF-α(27568.09±2706.38 pg/m L vs.35040.75±892.64 pg/m L)浓度均低于LPS-DCs对照组,P0.05,因此选用UCN诱导t DCs。(2)UCN-DCs组相比对照组im DCs表面共刺激分子的表达丰度CD40(55.03±3.87 vs.65.38±1.62)%、CD80(70.38±2.30 vs.77.10±2.56)%、CD86(70.30±2.37vs.73.90±3.49),均明显下调,P0.05。(3)DCs与T细胞2:1、4:1以及8:1混合培养时UCN-DCs组CFSE标记的T细胞增殖的百分比(22.89±2.49 vs.48.10±1.53)%、(1.92±1.42 vs.59.81±1.86)%、(5.94±0.77 vs.35.40±2.20)%均低于Ctrl-DCs组,P0.05。(4)偶联UCN后,7.8μg/ml浓度下S-DCs组和L-DCs组的细胞存活率均高于90%,因此本研究中选用7.8μg/ml为GO工作浓度。(5)UCN与小片径GO的偶联效率高于?-MSH、VIP和AM,分别为(89.33±1.53 vs.76.00±2.65 vs.47.33±1.15 vs.36.00±2.01)%,与大片径GO的偶联效率也高于其他组,分别为(86.33±1.53 vs.55.67±0.58 vs.35.33±2.08 vs.32.67±1.73)%,P0.05。(6)给予低剂量LPS刺激后,UCN-S-DCs组和UCN-L-DCs组分泌的促炎类细胞因子浓度均低于UCN-DCs组,分别为IL-12p70(61.85±4.99 pg/m L vs.61.03±0.52pg/m L vs.68.99±3.91 pg/m L)、IL-6(19935.66±1286.64 pg/m L vs.22733.32±5396.41 pg/m L vs.30440.11±1655.73 pg/m L)、IL-1β(1395.66±62.12pg/m L vs.1394.44±62.12 pg/m L vs.1566.65±13.82 pg/m L)、TNF-α(64292.69±1278.26 pg/m L vs.61986.79±2537.94 pg/m L vs.71771.30±883.27 pg/m L),P0.05。(7)活体成像软件分析由脚垫迁移至PLN的DCs比例:Ctrl-DCs组DC在24 h、48 h、72 h迁移到PLN的百分比分别为(0.04±0.02)、(0.07±0.02)、(0.09±0.02),UCN-DCs组在24 h、48 h、72 h迁移到PLN的百分比分别为(0.06±0.03)、(0.10±0.05)、(0.11±0.01),UCN-S-DCs组在24 h、48 h、72 h迁移到PLN的百分比分别为(0.10±0.06)、(0.11±0.02)、(0.15±0.02),UCN-L-DCs组在24 h、48 h、72 h迁移到PLN的百分比分别为(0.22±0.07)、(0.23±0.07)、(0.23±0.04);其中UCN-L-DCs组DC在24 h、48 h、72 h迁移到PLN的百分比均高于UCN-DCs组和Ctrl-DCs组,且其在72 h百分比高于UCN-S-DCs组;UCN-S-DCs组在48 h、72 h迁移到PLN的百分比高于UCN-DCs组和Ctrl-DCs组,P0.05。综上,脚垫迁移模型中,不同处理方式DCs的迁移速率顺序为:UCN-L-DCsUCN-S-DCsUCN-DCsCtrl-DCs/S-DCs/L-DCs(ns:三者无明显差异)。(8)T细胞可视化a GVHD小鼠模型监测UCN-DCs抑制T细胞增殖的效果:在移植第6天时,各组小鼠体内总荧光强度均低于BM+Tc组(8.18?108±3.06?107),Ctrl-DCs组、S-DCs组、L-DCs组受鼠体内总荧光强度分别为(1.23?108±1.54?107)、(1.29?108±1.41?107)、(1.47?108±1.41?107),UCN-DCs组、UCN-S-DCs组和UCN-L-DCs组受鼠体内总荧光强度分别为(5.19?107±1.47?106)、(1.28?107±4.00?105)、(2.33?107±2.25?106);其中,UCN-DCs组总荧光强度低于Ctrl-DCs组,UCN-S-DCs组和UCN-L-DCs组总荧光强度低于UCN-DCs组,差异有统计学意义,P0.05,Ctrl-DCs组、S-DCs组和L-DCs组间无统计学差异,P0.05。结论:UCN抑制DCs分泌促炎细胞因子能力显著高于另外3种神经肽,故选用UCN诱导t DCs进行后续实验。进一步研究发现UCN能明显抑制DCs共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达,即UCN-DCs成熟度降低,暗示其激活T淋巴细胞的能力可能下降。CFSE-T细胞增殖实验表明UCN-DCs能诱导T细胞沉默,抑制其增殖。采用不影响DCs增殖的工作浓度即7.8?g/ml的GO与UCN高效偶联(偶联率约89%)后处理im DCs,体系细胞因子表达水平分析表明不同片径GO载体能有效递送UCN,并进一步增强其抑制DCs分泌促炎细胞因子的能力。后续脚垫输注模型及可视化模型数据显示,UCN-GO促进了DCs的局部迁移能力,初步证明其能有效地抑制T细胞在a GVHD小鼠体内增殖。综上,本研究为UCN-GO复合物诱导耐受性DCs抑制a GVHD提供了基础的实验数据和科学依据,具备潜在应用价值,可为临床转化提供参考。
【图文】：
位论文 神经肽-氧化石墨烯诱导耐受性树突状细胞抑制急性移植物抗宿主 对 imDCs 表面共刺激分子及趋化因子受体表达的影响来源的 imDCs 培养至第 5 天与 RAPA（100 ng/mL）或 P集细胞进行流式细胞术检测，分析 DCs 表面共刺激分D86, MHCII 分子及趋化因子受体 CCR1、CCR5 和 CC果表明，相较于 PBS 对照组，RAPA 可显著降低 DCs 达丰度（图 1-1A，表 1-1）。趋化因子受体表达分析表明 CCR1 和 CCR5 有抑制作用（P < 0.05），而对 CCR7 1-1B）。
以 C57BL/6J 小鼠（H-2Kb）作为受鼠，，BALB/C 小鼠（H-2Kd）作为供鼠进行异基因型造血干细胞移植。受体小鼠在 0 d 进行 60Coγ（8.5 Gy）照射后，6 h 内经尾静脉输注供者骨髓细胞和脾细胞混合液，考察不同时间点供者植入情况（图 1-2A）及小鼠存活变化（图 1-2B）。结果显示，经 TBI照射后 BALB/C 为供者的小鼠可形成完全的供体植入，小鼠 MHC 由 H-2Kb转换为 H-2Kd。对移植小鼠进行观察发现，同基因移植组小鼠无明显变化，且可全部存活；TBI 组小鼠明显消瘦，活动度迅速下降，在实验第 11 d 全部死亡。相比之下，异基因移植组小鼠在实验第 3 d 至第 5 d 体重明显下降、出现弓背，且毛发絮乱并缺乏光泽，活动度下降合并腹泻，皆为 aGVHD 典型症状，实验第 17 d 该组小鼠全部死亡。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
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本文编号：
2640061
