Ⅰ型单纯疱疹病毒UL2蛋白核输入信号和核输入机制的鉴定及其重组病毒的构建

发布时间：2020-05-01 22:41

【摘要】：Ⅰ型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)是人群中常见的病毒,可引起人类多种疾病,已成为严重危害人类健康的重要病原之一,目前尚无有效的药物和疫苗。HSV-1 UL2基因编码的UL2蛋白是一种尿嘧啶-DNA糖基化酶(Uracil-DNA glycosylase,UDG),它能精确地从合成的DNA中切除错误掺入的尿嘧啶,这在病毒复制过程中的碱基修复中起着重要的作用。此外,虽然UL2对病毒在体外细胞培养中的复制不是必需的,但是对病毒在神经元中的有效复制是必需的。因此,UL2在病毒的致病性、潜伏和再激活中可能发挥着重要作用。目前,关于HSV-1 UL2在病毒感染中的确切功能还不是很清楚。本研究中,为了分析UL2在活细胞中的分布情况,我们利用分子克隆技术首先将UL2的全长开放读码框与增强型黄色荧光蛋白(Enhanced yellow fluorescence protein,EYFP)融合构建相应真核表达质粒,将其转染COS-7细胞后发现,在其它病毒蛋白不存在的情况下,UL2在活细胞内主要定位在细胞核内,证实它是一个核靶向蛋白。通过构建一系列与EYFP融合的UL2缺失或定点突变体表达质粒并将其转染COS-7细胞后进行荧光定位分析,结果发现UL2含有一个功能性的核输入信号(Nuclear localization signal,NLS)(~1MKRACSRSPSPRRRPSS~(17)),它的关键氨基酸(Amino acids,aa)是~(12)RRR~(14)。同时,我们也证实预测的核输出信号(Nuclear export signal,NES)不起作用。利用Ran-GTP、importinα/β显性负突变体和抑制剂及免疫共沉淀实验等进一步研究显示,UL2是在RanGTP提供能量情况下通过importinα1、α5、α7、β1和transportin-1多种受体介导的方式进入细胞核。此外,异源核融合实验证实了UL2是一种核质穿梭蛋白。根据鉴定到的UL2 NLS及其关键aa,我们利用Red同源重组技术在含HSV-1BAC Luc的大肠杆菌GS1783中构建了UL2 NLS突变型(UL2 NLSm)、UL2缺失型(?UL2)和UL2回复型(?UL2R)相关重组病毒的细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC),并将它们转染Vero细胞后获得相应重组病毒。通过病毒滴度测定实验确定了获得的重组病毒滴度,同时重组病毒的生长曲线实验结果表明UL2的核输入对病毒的有效复制是至关重要的,UL2缺失的病毒的复制减弱。因此,以上这些研究结果将为深入阐明UL2在HSV-1感染中的生物学功能奠定基础,也为进一步的抗病毒药物靶点设计和疫苗研制提供理论依据。
【图文】：

结构模式

AHSV-1的结构模式图

模式图,基因结构,模式图,衣壳

衣壳和包膜之间蛋白区域组成的无规则结构，称为皮层。HSV-1 的基因组是一个大小约 150Kbp 的线性双链 DNA 分子，其结构由两个共价连接的片段 L（长）和S（短片段）组成，两侧是反向重复序列IRL和TRL以及IRS和TRS（图1-1B）。而衣壳呈二十面体立体对称，由4种蛋白组成，它们分别是主要衣壳蛋白（VP5）、支架蛋白（pre-VP22a）、VP19C 和 VP23。HSV-1 的包膜含有大约 11 种病毒糖蛋白，，其中 4 种糖蛋白（gD、gH、gL 和 gB）是 HSV-1 进入细胞所必需的。gC 和
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373.11

【参考文献】