Dkk1在骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化的分子调节机制的实验研究

发布时间：2020-05-05 05:21

【摘要】：[目的]通过DKK1干扰探讨DKK1在骨髓间充质干细胞早期成骨、成脂分化的调节作用,分析其调节机制。 [方法]1. Real time-PCR检测骨髓间充质干细胞成脂、成骨诱导培养早期Dkkl基因表达水平；骨髓间充质干细胞激素作用下DKK1基因表达检测。2.根据shRNA靶位点的选择原则,从TRC shRNA数据库及Ambion shRNA数据库中择优选取三条DKK1shRNA序列,通过DKK1构建过表达载体,筛选出最佳干扰序列,体外同源重组构建DKK1-shRNA腺病毒表达载体,经酶切、PCR鉴定、测序。 3. rAd-EGFP转染骨髓间充质干细胞荧光表达观察；腺病毒对细胞增殖影响分析；Ad-DKK1-shRNA转染骨髓间充质干细胞,转染后分别行成脂、成骨诱导培养,分别检测其分化特异因子以及相关的特异蛋白的表达水平,分析其与对照组数据的差异性。并行组织染色观察其形态学变化。 [结果]1.实验应用real time-PCR检测Dkkl基因在大鼠BMSCs成脂、成骨分化48小时内的相对基因表达水平,通过目的基因的扩增动力学曲线得出Ct值,经内参β-actin校正计算出目的基因的相对表达量ΔCt值,组间比较采用两独立样本t检验：成脂组与正常对照组,在成脂诱导6、12、24、48时dkkl基因表达水平较对照组增高,差异有统计学意义,P0.01。成骨组与正常对照组,0.5、6两个时间点Dkkl基因表达量较对照组明显降低,差异有统计学意义,P0.05。骨髓间充质干细胞激素处理3、6、12、24时,real time-pcr检测DKK1基因表达,结果显示激素作用下,骨髓间充质干细胞DKK1表达明显增加。2.成功构建pYr-1.1-DKK1-shRNA-153、 pYr-1.1-DKK1-shRNA-155、pYr-1.1-DKK1-shRNA-Am表达载体,分别通过RT-PCR与Western blotting检测DKK1的表达,结果显示pYr-1.1-DKK1-shRNA-153为最佳干扰序列。3.荧光显微镜下观察荧光蛋白表达情况显示,MOI-10、20均可较高的转染骨髓间充质干细胞；腺病毒转染骨髓间充质干细胞,MOI-5、10、20、30、40、50pfu/cell在转染后3天,对细胞增殖无明显影响；sh-DKK1明显抑制骨髓间充质干细胞成脂分化。sh-DKK1促进成骨蛋白Osteocalcin表达和coll-I蛋白表达。 [结论]Dkkl在骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化早期可能起重要的调节作用,激素可能通过调节DKK1的表达而发挥调节成骨、成脂分化的作用DKK1干扰明显抑制骨髓间充质干细胞早期成脂分化,促进骨髓间充质干细胞成骨蛋白表达,促进早期成骨分化。DKK1在骨髓间充质干细胞早期成骨、成脂分化中发挥重要调节作用。
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2

【参考文献】