LytR蛋白参与肺炎链球菌荚膜多糖和磷壁酸的表面锚定作用研究

发布时间：2020-05-08 08:00

【摘要】：目的肺炎链球菌的荚膜多糖(Capsule,CPS)是肺炎链球菌重要的毒力因子,而磷壁酸(teichoic acid,TAs)是革兰阳性菌细胞壁上特有的成分并且维持细胞形态,两者都在细菌的粘附、侵袭的过程中发挥了重要作用,但它们锚定到细胞壁的合成过程尚不清楚。LytR蛋白(SPD_1741)属于LytR-Cps-Psr(LCP)家族成员,LCP蛋白家族在多种细菌中被证明参与细胞壁多糖锚定在肽聚糖上的过程,但尚不清楚LytR(SPD_1741)蛋白是否参与肺炎链球菌细胞壁多糖的表面锚定过程。本研究初步探索了LytR蛋白(SPD_1741)在细菌荚膜多糖和磷壁酸表面锚定中的作用,并进一步观察了其对细菌表型和毒力的影响,为了解肺炎链球菌荚膜和磷壁酸生物合成的分子机制提供新的实验证据,并为抗肺炎链球菌感染的治疗提供新的作用靶点。方法采用Western blot技术分析LytR蛋白的表达时相;通过流式细胞术(FACS)测定野生菌表面的LytR蛋白含量并确定LytR蛋白的位置;采用长臂同源重组技术构建ΔlytR缺陷菌,采用质粒pJWV25构建lytR异位回补菌;体外培养野生菌、ΔlytR缺陷菌、lytR异位回补菌和外源性添加Lyt R蛋白的缺陷菌,绘制生长曲线以观察细菌的繁殖能力,并利用透射电镜观察细菌的细胞壁及荚膜的变化;利用Western blot,ELISA和Dot blot等技术检测野生菌、ΔlytR缺陷菌、lytR异位回补菌和外源性添加Lyt R蛋白的缺陷菌磷壁酸和荚膜多糖变化;通过细胞粘附实验,抗巨噬细胞吞噬能力实验,鼻腔攻毒实验分析细菌的毒力差异;采用EMSA实验分析LytR蛋白与lytA、cps、raf X操纵子启动子结合情况。结果LytR蛋白在野生菌的不同生长时期的表达量较高且无显著差异。FACS结果显示LytR蛋白可表达于细菌的表面;相比D39野生菌,D39ΔlytR缺陷菌表现出生长迟缓、平台期变短、自溶提前、细胞壁不完整、磷壁酸含量减少、荚膜残缺的现象。D39lyt R异位回补菌及外源性添加蛋白的D39ΔlytR缺陷菌,其生长均得到恢复,荚膜和细胞壁与D39野生菌则无显著差异。相比D39野生菌、D39lyt R异位回补菌、外源性添加蛋白的D39ΔlytR缺陷菌,D39ΔlytR缺陷菌全菌的荚膜多糖和磷壁酸的含量明显减少(p0.05),而在其培养上清中的含量却明显增加(p0.05)。体外粘附实验显示R6Δlyt R缺陷菌相比野生菌的粘附能力显著下降(p0.05)。体外抗吞噬实验显示巨噬细胞对D39ΔlytR缺陷菌较野生菌粘附的能力显著减弱(p0.05)。小鼠感染D39野生菌死亡率达到83.3%,而感染D39ΔlytR缺陷菌死亡率为0%,二者有显著差异(p0.05)。感染D39野生菌的小鼠肺组织出现了大量的炎症细胞浸润、充血、肺间质增生等变化,而感染D39ΔlytR缺陷菌小鼠的肺部炎症反应较轻。EMSA结果显示LytR蛋白并未与lytA、cps、rafX操纵子启动子特异结合。结论LytR蛋白在肺炎链球菌中稳定表达,可能参与荚膜多糖、磷壁酸在细胞壁表面的锚定过程,并影响到细菌的形态、生长、自溶和毒力。
【图文】：

重庆医科大学硕士研究生学位论文为了研究 LytR 蛋白的功能，，我们采用长臂同源重组的方式，利用 erm 基因取代 lytR 基因的方式构建Δ lytR 缺陷菌。首先，利用特异引物（LytR P1、P23、P4）分别扩增 lytR 基因上游侧臂 820 bp（lytR UP）及其下游侧臂 820 bp（lW）片段（图 1A）；随后，利用 PCR 技术 lytR UP 上游 ,erm 抗性基因盒和 lytR D游相连接（图 1A），将连接片段转化至 S.pn D39 菌株中。采用具有红霉素抗血平板进行初步筛选。随机挑选两个单克隆菌落（C1 和 C2），用 PCR 和 Westlot 鉴定。图 B 表明，lytR 片段存在于野生菌中，并不存在于Δ lytR 缺陷菌中。rm 片段存在于Δ lytR 缺陷菌中，却并不存在于野生菌。该结果证明已成功构建 lytR 缺陷菌。 实验结果.1 构建并验证ΔlytR 缺陷菌

3.2 构建并验证ΔlytR mutant-complement 回补菌利用限制性内切酶Spe I 和Not I将基因lytR全长片段与pJWV25质粒相连接，随后将重组质粒转化至 S.pn D39 菌株中进行筛选。随机挑选菌落进行 PCR 验证后，再送北京擎科科技有限公司进行 DNA 序列测定和进行 Western bolt 验证。图 2A显示测定的 DNA 序列与 lytR 序列百分之百吻合，图 2B 显示，WT 肺炎链球菌在35kDa 分子量与 40kDa 分子量之间的位置有一清晰杂交条带，与 lytR 的分子量相吻合，即该条带为 LytR 蛋白；而Δ lytR mutant-complement 回补菌在 55kDa 分子量与 70kDa 分子量之间的位置有一条清楚的杂交条带，而 LytR 分子量为 37.57 kDa加上标签蛋白 GFP（分子量 26.9 kDa），刚好为 64.47kDa 分子量，提示该条带为LytR 与 GFP 的融合蛋白条带，这一结果证明Δ lytR mutant-complement 回补菌可以成功的表达 LytR 蛋白。以上的结果显示，成功构建了Δ lytR mutant-complement 回补菌(简写为Δ lytR-C)。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R378.14

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本文编号：2654372