Trex1自身免疫性疾病小鼠模型的构建及研究

发布时间：2020-05-12 12:18

【摘要】：自身免疫性疾病是由机体免疫功能紊乱而引起自身免疫反应的慢性疾病,目前全球有数以千万的人正遭受此类疾病的困扰,但病因仍然不明。核酸酶在DNA复制、损伤、错配修复和维护基因组DNA稳定性中扮演着重要作用,Trex1是哺乳动物细胞中最丰富的核酸外切酶,可降解胞内中异常或错配的DNA。近年来发现Trex1的位点突变与多种自身免疫性疾病有关,探讨二者间的关系对阐明自身免疫反应病理机制有着重要意义。本研究通过运用CRISPR/Cas9技术与重组蛋白的表达、Western Blot、qRT-PCR流式细胞术等方法,对Trex1及其突变对自身免疫性疾病的关系进行了探讨。我们首先通过CRISPR/Cas9技术建立了 Trex1基因敲除的细胞模型,发现Trex1基因缺失可以引起了 DNA免疫通路的应答。Trex1多种位点突变中,D18N突变发生于DNA催化酶活性的结构域,与自身免疫性疾病家族性冻疮样狼疮(FCL)有关,但未见较深入研究报告。因此,我们研究了 Trex1 D18N突变对自身免疫反应的影响。我们首先在E.coli构建并表达了 Trex1 D18N重组蛋白。体外实验发现Trex1 D18N突变造成DNA酶活性的丧失。接着,通过CRISPR/Cas9技术构建Trex1 D18N小鼠模型,与野生型相比,该模型在无刺激的情形下,胚胎成纤维细胞有较高水平的I型干扰素的表达,血浆中炎症因子表达明显升高,体内CD4+T细胞数增高。这些结果表明Trex1 D18N突变可以造成自身免疫反应,其所构建的Trex1 D18N可做为自身免疫性疾病研究的模型,为Trex1在自身免疫性疾病中的作用机制及靶点研究打下了坚实的基础。
【图文】：

首先我们选定了在Ｔｒｅｘｌ的第十八位氨基酸碱基序列位置前后设计了三个逡逑ｓｇＲＮＡ，将目的基因Ｔｒｅｘｌ的三个不同ｓｇＲＮＡ经过退火后与酶切后的ＰＸ４５８连接，逡逑经转化得到的菌液进行测序并比对（图１－１），结果显示三个ｓｇＲＮＡ都有连接上ｐＸ４５８逡逑载体，说明载体构建成功。逡逑．Ｉ邋＇邋＇邋Ｉ邋１邋？邋｜逦｜邋１邋？邋？邋？邋｜逦｜逦＇邋Ｉ邋＇邋？邋？邋？邋Ｉ邋？邋＊邋？邋？邋Ｉ邋？邋？邋？邋？邋Ｉ邋？邋？邋？邋？邋Ｉ邋＊邋｜邋？邋｜邋Ｉ邋＊邋？邋？邋？邋Ｉ邋Ｉ邋？邋Ｉ邋？邋Ｉ邋Ｉ邋？邋Ｉ邋？邋Ｉ邋Ｉ邋？邋？邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋？邋？邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋ｔ邋｜邋Ｉ邋Ｉ逡逑逦＾逦３０逦４０逦５０逦６０逦７０逦８０逦Ｓ０逦１００逦１１０邋＾逡逑ｒｉｇｌ－ＤｌＳＮ１？逦ＣＡＣＣＧＧＡＣＣＣ：ＣＡＴＣｒｒＣ￣－ＡＧＡＣＣ逡逑ｐＸ４５８－ｓｇｌ－Ｔｒｅｘｌ－Ｄ１８Ｎ邋ＢＩＦ逦ｉ邋：邋Ｃ：邋：３：ＧＧ．；．；３＾．ＣＧ．；＾ＣＡＣＣ－３Ｇ．；ＣＣＣ：ＣＡ：邋？：．邋：邋Ｃ邋：邋．．；３．；ＣＣＧ：邋；邋：邋：ＡＧ？３Ｃ：ＡＧＡ．；．；：Ａ３：Ａｉ．＜３：逦：－邋：邋．邋．邋：？逡逑ｙ邋，邋》Ｉ１１？？Ｉ｜｜｜雷邋ｌ？｜V尊邋Ｉ邋ｉ邋警邋？ｉ邋Ｉ邋ｉ邋g？邋？邋Ｉ邋春邋ｉ邋？尊邋Ｉ邋？言邋《邋ｉ邋Ｉ邋ｉ邋？邋？邋？邋１１逦？邋Ｉ邋ｉ？？ｉ邋Ｉ邋ｉ邋ｉ邋？

５：ｐｘ４５８－ｓｇ３－Ｔｒｅｘｌ－Ｄ１８Ｎ邋ＷＴ逡逑６．ｐｘ４５８－ｓｇ３－Ｔｒｅｘｌ－Ｄ１８Ｎ邋ＷＴ＋ｔ７ｅｌ邋ｅｎｚｙｍｅ逡逑图１－４Ｔ７Ｅ１酶切逡逑Ｆｉｇｌ－４邋Ｔ７Ｅ１邋Ａｓｓａｙ逡逑图为琼脂糖凝胶电泳图，箭头处Ｉｎｄｅｌ表示出现缺失或插入，，Ｍａｒｋｅｒ：２０００ｂｐ。逡逑１．３．３敲除重组细胞的分选验证逡逑由于选用的ｐＸ４５８载体自身带着ＧＦＰ焚光信号，在验证Ｔｒｅｘｌ敲除重组质粒确逡逑实能够有效的进行基因编辑后，我们将这些细胞消化下来在无菌情况下进行流式分逡逑选（图１－５）
【学位授予单位】：福建师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R593.2;R-332

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本文编号：2660208