EGFR特异性嵌合抗原受体慢病毒载体构建及荧光素酶标记靶细胞制备

发布时间：2020-05-17 00:10

【摘要】：目的:制备特异性抗人表皮生长因子受体(EGFR)的单链抗体(scFv),并鉴定其生物学功能。构建靶向人EGFR的慢病毒载体,通过转染293T细胞制备病毒液,测定病毒滴度,感染293FT细胞鉴定表达。构建稳定表达萤火虫荧光素酶(Fluc)和红色荧光蛋白(RFP)的人肺癌细胞系,为建立活体成像的人肺癌裸鼠移植瘤模型建立及进一步研究基于EGFR单链抗体的免疫治疗奠定基础。方法:从分泌抗人EGFR单克隆抗体的杂交瘤细胞系提取总RNA,利用5’RACE技术扩增轻链和重链可变区(V_L、V_H)基因,构建具有V_L、V_H基因的单链抗体基因,并将构建的单链抗体基因克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中进行表达和鉴定。ELISA鉴定单链抗体对抗原的特异性;Fortebio检测抗原抗体间的亲和力,流式细胞术检测单链抗体结合肺癌细胞系天然EGFR的功能活性。设计以EGFR-scFv靶向EGFR的CAR结构,将此目的基因连接到慢病毒载体并转染293T细胞,收集病毒液后,利用qRT-PCR法检测病毒的滴度。构建荧光素酶和红色荧光蛋白的慢病毒载体pHBLV-Fluc-RFP,转染293T细胞进行病毒包装,完整病毒感染人肺癌细胞系A549、H1975和人B细胞淋巴瘤细胞系K562,用嘌呤霉素筛选获得稳定细胞株,分别用荧光显微镜、定量PCR检测确证红色荧光蛋白和荧光素酶表达。结果:获得唯一的轻重链可变区序列V_L、V_H,成功构建EGFR-scFv,特异性与天然EGFR蛋白结合,亲和力达3.22×10~(-9)mol/L。构建含有EGFR-scFv的慢病毒载体,将构建好的慢病毒载体转染293T细胞。收集的病毒浓缩液经稀释后感染293T细胞,采用qRT-PCR方法成功完成病毒滴度的测定,且用慢病毒感染293T细胞显示病毒可以正常表达。成功构建pHBLV-Fluc-RFP慢病毒载体,获得了稳定表达荧光素酶和红色荧光蛋白的A549、H1975和K562细胞。结论:成功构建了抗人EGFR单链抗体,并以此为基础构建了EGFR-scFv-CD28-CD137-CD3结构慢病毒表达载体,通过转染293T细胞包装成慢病毒颗粒,获得了该基因的病毒液,并测定了病毒液滴度,通过感染细胞后用流式细胞术鉴定了外源修饰目的基因的表达,为肺癌免疫导向治疗研究奠定了基础。获得的红色荧光蛋白和荧光素酶双表达人肺癌细胞系A549、H1975和人B细胞淋巴瘤细胞系K562,为人肺癌细胞免疫缺陷小鼠模型活体成像提供新荧光配色细胞模型。
【图文】：

ELISA检测抗人EGFR单克隆

SDS-PAGE Western blot图 3 单链抗体表达的 SDS-PAGE 和 Western 鉴定M：蛋白 Mark；1-3：转染后第 2、第 4 和第 6 天收集的细胞培养上清在还原条件条带；N1：还原条件下的阴性对照；4-6：转染后在第 2、第 4 和第 6 天收集的上清在非还原条件下的条带；N2：非还原条件下阴性对照；P：阳性对照：multi
【学位授予单位】：北京市结核病胸部肿瘤研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

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本文编号：2667579