【摘要】：第一部分脂肪干细胞的体外分离、培养、纯化及鉴定目的:寻求一种在体外分离、培养、纯化及鉴定SD大鼠脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)的有效可行而又简单方便的方法,并检测其成骨分化能力,为后续的相关实验提供可靠的细胞来源。方法:1、选取健康成年SD雄性大鼠,剪取腹部和腹股沟处皮下脂肪组织,组织块贴壁法进行培养。通过体外培养及连续传代的方式,对ADSCs进行扩增、纯化。2、倒置相差显微镜观察脂肪干细胞的形态变化。免疫荧光法鉴定脂肪干细胞膜表面抗原CD44。3、对分离培养出的细胞进行成骨诱导分化及茜素红染色,观察并鉴定脂肪干细胞的成骨分化潜能。结果:1、取材6小时即后可见脂肪干细胞散在分布、贴壁;3天后贴壁细胞粘附牢固,细胞体积变大,颗粒明显增多,生长力旺盛,部分已呈现出集落生长;7天后细胞体变得狭长,呈梭行、涡旋状排列。传代细胞形态稳定且均一。2、取第四代传代培养脂肪干细胞,常规消化脱壁,用免疫荧光法检测表面抗原CD44呈阳性表达。3、脂肪干细胞成骨诱导分化后形成质地致密的细胞团,予茜素红染色后呈现大量橘红色的钙结节。结论:使用脂肪组织块贴壁法并连续传代法得到纯化的脂肪干细胞的方法,既简单方便,又高效。使用该方法得到的脂肪干细胞性状稳定、状态良好、生长力旺盛、成骨分化潜力较大,可作为理想的种子细胞,为后续的实验提供可靠的、稳定的细胞来源。第二部分Wnt通路和BMP-2互反馈调节在脂肪干细胞成骨分化中的机制目的:在ADSCs成骨诱导分化过程中,观察Wnt通路与BMP-2的表达,及其之间的相互关联,并研究Wnt通路调控BMP-2表达,从而调节ADSCs成骨分化的作用及机制;反过来,BMP-2过表达又反馈性的调节Wnt通路活性,从而影响ADSCs成骨分化。为精确调控ADSCs分化,促进骨性关节炎愈合及创伤的恢复,丰富再生医学提供理论依据。方法:1、Li Cl刺激干预体外培养的ADSCs,通过CCK-8法观察ADSCs的增殖活性,通过Western blot法检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达情况。2、成骨诱导分化过程中,Western blot、RT-q PCR法分别检测ADSCs成骨分化各时期成骨指标BMP-2、RUNX2,以及Wnt通路的关键分子β-catenin、Wnt5a的表达情况;3、分别用Li Cl、DKK-1刺激干预ADSCs成骨诱导分化,检测分化早期(第3天)、分化中期(第7天)、分化晚期(第14天)、分化后期(第17天)成骨指标BMP-2、RUNX2,以及Wnt通路的关键分子β-catenin、Wnt5a的表达情况。4、BMP-2慢病毒载体阳性转染ADSCs后,Western blot、RT-q PCR法分别检测ADSCs成骨分化各时期成骨指标BMP-2、RUNX2,以及Wnt通路的关键分子β-catenin、Wnt5a的表达情况。在成骨诱导分化后期第17天,免疫荧光法检测RUNX2表达情况,Western blot法检测成骨指标BMP-2、RUNX2,以及Wnt通路的关键分子β-catenin、Wnt5a的表达情况。结果:1、Li Cl刺激组的ADSCs增值潜力增强,且PCNA蛋白呈现高表达。2、ADSCs成骨诱导分化过程中,随着时间的推移,成骨指标BMP-2、RUNX2的表达先增强后减弱;Wnt通路关键分子β-catenin的表达先增加后减少,Wnt5a表达则呈现先减少后增加的趋势。3、成骨诱导分化早期(第3d),Li Cl促进β-catenin的表达,Wnt5a表达减弱,DKK-1抑制β-catenin的表达,Wnt5a表达增强,Li Cl组成骨相关指标BMP-2、RUNX2表达增强,DKK-1组则表达减弱。ADSCs成骨诱导分化中期(第7d)、晚期(第14d),Li Cl组成骨指标BMP-2、RUNX2表达增强,同时Wnt通路关键分子β-catenin的表达上调,Wnt5a的表达下调。DKK-1组结果则相反;4、ADSCs成骨诱导分化后期(第17-25d),随着时间的推移,阴性对照组BMP-2、RUNX2表达降低,β-catenin表达下调,Wnt5a蛋白表达上调。Li Cl组BMP-2、RUNX2蛋白表达减弱,β-catenin表达上调,Wnt5a的表达下调,DKK-1组结果相反。5、对ADSCs成功转染BMP-2慢病毒后,在ADSCs成骨诱导分化过程中(第3d、7d、14d),BMP-2慢病毒转染组BMP-2、RUNX2的表达均增强,Wnt5a的表达下调;在ADSCs成骨诱导分化第17d,即BMP-2慢病毒过表达时期,免疫荧光法检测RUNX2表达显著,Western blot检测BMP-2慢病毒转染组的BMP-2、RUNX2蛋白表达增加,β-catenin表达上调、Wnt5a表达则下调。结论:1、Li Cl能激活Wnt通路,促进ADSCs增殖分化。2、在ADSCs成骨诱导分化中,Li Cl激活Wnt通路关键因子β-catenin表达,同时下调了Wnt5a的表达,在成骨诱导分化中,早期主要促进ADSCs快速增殖,上调BMP-2促进成骨诱导分化;中期、晚期继续上调BMP-2促进成骨诱导分化;后期逐渐下调BMP-2的表达,不利于ADSCs成骨诱导分化。而DKK-1抑制组作用相反。3、BMP-2过表达反馈促进Wnt通路关键因子β-catenin的表达,下调了Wnt5a的表达,继续促进成骨诱导分化。
【图文】：
（11）吸弃 PBS，加入茜素红染色；（12）吸弃茜素红染色液，2ml 冷 PBS 轻柔冲洗 3 遍；（13）光学相差显微镜下观察染色情况，拍照记录。3 结果3.1 SD 大鼠脂肪干细胞的形态学性状观察（1）6h 后，培养瓶底粘贴附着大量脂肪贴壁细胞，散在分布，细胞核清晰，散在少量杂质细胞（图 1-1）；（2)3d 后，脂肪贴壁细胞牢固粘附，生长良好，颗粒增多，，细胞体积较前增大，遮光性弱，局部呈现出集落生长（图 1-2)；(3)7d 后，可见贴壁细胞形态基本上已经呈现出一致性，细胞体此时变得狭长，呈梭行或漩涡状排列。清晰可见椭圆形的细胞核（图 1-3）。
注：图 2-1.CD44 阳性表达显示红色荧光图 2-2.DAPI 复染核呈蓝色图 2-3.合成染色情况3.3 SD 大鼠脂肪干细胞成骨分化潜能鉴定给予茜素红染色后，100 倍镜下（图 3-1）和 400 倍镜下（图 3-2)可观察到大量橘红色的钙结节形成。
【学位授予单位】：广西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2
【参考文献】
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2671375
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