副粘病毒HN蛋白颈部与F相互作用区结构与功能分析

发布时间：2020-05-21 20:33

【摘要】：背景:人副流感病毒3型(human parainfluenza virus type 3,hPIV3)与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是副粘病毒(Paramyxovirus)的典型代表,并且两者结构高度类似,其中hPIV3主要引起人类呼吸系统和生殖系统疾病,NDV通过被感染禽类的口腔粘液及粪便传播,导致禽类发生呼吸系统及神经系统疾病,具有高度致死性,人类接触被感染禽类亦可导致淋巴腺炎及结膜炎,针对这两种病毒的感染至今仍然没有有效的防治措施,主要原因在于尚未明确致病机制中病毒与靶细胞的融合机制。血凝素-神经氨酸酶(Hemagglutinin-neuraminidase,HN)和融合蛋白(Fusion protein,F)是镶嵌在副粘病毒包膜上的两种糖蛋白,由病毒基因编码产生的。两者的相互作用是决定病毒宿主范围、毒力和传播的关键,并且HN与F的相互作用区定位于HN的颈部,目前关于HN颈部与F相互作用区(Fusion interaction region,FIR)的各个氨基酸的功能尚不清楚。在本研究中,选取NDV HN及hPIV3 HN作为研究对象,将HN颈部与F相互作用区互相置换,构建嵌合体。通过比对HN颈部与F相互作用区序列,进一步确定了该区域存在的两个保守氨基酸位点,即第51位丝氨酸(Serine,S51)和第55位天冬氨酸(Aspartic acid,D55),并将其突变为丙氨酸(Alanine,A)。通过检测嵌合体及突变体功能的改变,明确颈部与F相互作用区对HN功能的影响及在这一区域中起关键作用的氨基酸位点,分析导致HN功能发生变化的原因,进一步加深对副粘病毒HN颈部在细胞融合机制中作用的理解。目的:1.确定HN颈部与F相互作用区(FIR)对于HN在促细胞融合机制中发挥作用产生的影响。2.定位HN颈部与F相互作用区的关键氨基酸。3.进一步探讨HN颈部与F相互作用的机制。方法:1.采用片段置换与同源重组相结合的方法,将NDV HN的颈部与F相互作用区置换为hPIV3的HN颈部与F相互作用区,构建嵌合体C1;同理,将hPIV3的HN颈部与F相互作用区置换为NDV HN的颈部与F相互作用区,构建嵌合体C2。2.通过定点突变与同源重组相结合的方法,将NDVHN颈部与F相互作用区的保守氨基酸,即第51位丝氨酸(S51)、第55位天冬氨酸(D55),均突变为丙氨酸(A),各突变体分别命名为NDVS51A、NDVD55A;hPIV3HN颈部与F相互作用区的保守氨基酸S51、D55均突变为丙氨酸后,分别命名为hPIV3 S51A、hPIV3D55A。3.将嵌合体及突变体通过真核瞬时表达系统进行表达。4.检测蛋白在细胞表面的表达效率:通过流式细胞术(Flow cytometry,FCM)定量测定各嵌合体及突变体在细胞表面表达效率;间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence,IFA)定性测定各嵌合体及突变体在细胞表面表达效率。5.检测促细胞融合活性:采用姬姆萨(Giemsa)染色法定性观察嵌合体及突变体引起细胞融合情况,指示基因法定量测定嵌合体及突变体的促细胞融合活性。6.检测受体识别活性:通过血吸附(Hemadsorption,HAD)实验定性测定各嵌合体、突变体受体识别活性,之后将吸附的红细胞裂解通过比色定量测定各嵌合体、突变体的受体识别活性。7.检测神经氨酸酶活性:通过神经氨酸酶检测试剂盒,利用β-半乳糖苷酶与嵌合体及突变体发生酶促反应,定量测定神经氨酸酶活性。8.半融合试验:通过R18荧光探针标记的新鲜红细胞悬液进行半融合试验,检测嵌合体及突变体对膜融合早期阶段产生何种影响。结果:1.DNA测序结果表明,NDV HN及hPIV3 HN颈部与F相互作用区的氨基酸片段已互相置换,嵌合体C1、C2构建成功,指定位点氨基酸已突变为丙氨酸,突变体质粒 NDVS51A、NDVD55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A 均定点突变成功。2.C1、C2、NDVS51A、NDVD55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A 的细胞表面表达效率分别为野生型的82.1%、81.8%、90.2%、88.3%、84.9%、92.8%,差别无统计学意义(P0.05)3.C1、C2、NDVS51A、NDVD55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A 的促细胞融合活性均有不同程度的下降,分别为野生型的7%、9%、27%、19%、17%和21%,差别均具有统计学意义(P0.05),C1、C2促细胞融合活性基本丧失。4.C1、C2、NDVS51A、NDVD55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A 的受体识别活性均有不同程度下降,分别为野生型的14.7%、22.3%、35.5%、28.8%、33.9%和40.2%,差别有统计学意义(P0.05)。5.C1、C2、NDVS51A、NDVD55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A 的神经氨酸酶活性分别为野生型的75.9%、80.5%、84.7%、72.7%、75.3%、73.4%,差别无统计学意义(P0.05)。6.C1、C2、NDVS51A、NDVD55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A 的半融合能力均下降,其中C1、C2半融合能力下降程度大。结论:1.副粘病毒HN颈部与F相互作用区对其发挥促细胞融合活性和受体识别合活性具有重要意义。2.hPIV3 HN、NDVHN颈部与F相互作用区中的关键氨基酸为第51位丝氨酸(S51)、第55位天冬氨酸(D55)。3.HN颈部与F相互作用区的嵌合体及突变体促细胞融合活性降低的原因可能为受体识别活性的降低阻滞了头-颈之间信号的传递,使颈部与F相互作用区未得到充分暴露,影响HN与F的相互作用。
【图文】：

序列,序列,相互作用,背景

图１邋ＮＤＶ及ｈＰＩＶ３颈部与Ｆ相互作用区序列逡逑背景高亮的Ｓ５１和Ｄ５５高度保守逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｔｈｅ邋Ｆ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ邋ｒｅｇｉｏｎ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｓｔａｌｋ邋ｄｏｍａｉｎ邋ｏｆ邋ＨＮ逡逑Ｓ５１邋ａｎｄ邋Ｄ５５邋ａｒｅ邋ｈｉｇｈｌｙ邋ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋ａｎｄ邋ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ａ邋ｒｅｄ邋ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ．逡逑

嵌合体,Giemsa染色,突变体,蛋白

箭头所指为合胞体，Ａ．ＮＤＶＨＮ嵌合体及突变体；Ｂ．ｈＰＩＶ３ＨＮ嵌合体及突变体逡逑Ｆｉｇ．３邋Ｇｉｅｍｓａ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｃｈｉｍｅｒａｓ邋ａｎｄ邋ｍｕｔａｎｔｓ，逡逑Ａｒｒｏｗｓ邋ｉｎｄｉｃａｔｅ邋ｔｈｅ邋ｆｏｒｍａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓｙｎｃｙｔｉｕｍ，，邋Ａ．邋ＮＤＶ邋ＨＮ邋ｃｈｉｍｅｒａ邋ａｎｄ邋ｍｕｔａｎｔｓ．邋Ｂ．邋ｈＰＩＶ３逡逑ＨＮ邋ｃｈｉｍｅｒａ邋ａｎｄ邋ｍｕｔａｎｔｓ．逡逑４１逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373

【参考文献】