表达狂犬病病毒糖蛋白重组9型腺相关病毒的构建与免疫原性研究

发布时间：2020-05-25 10:46

【摘要】：狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染引起的一种古老的急性、高致死性人兽共患病。全球平均每年仍有大约55,000人死于狂犬病,我国是狂犬病的高发区。狂犬病病毒属于弹状病毒科狂犬病病毒属成员,具有强烈的嗜神经性,一旦发病病死率几乎为100%。疫苗免疫是目前防治狂犬病最为有效的方法。但目前的疫苗存在免疫程序复杂、免疫后抗体产生迟缓,抗体维持时间短等缺点,亟待研制新型狂犬病疫苗。9型腺相关病毒(Adeno-associated virus type 9,AAV9)为细小病毒家族依赖病毒属的缺陷型病毒,其作为基因工程疫苗载体具有安全性高、可持续表达外源基因等优点,具有极低的免疫原性和毒性的同时,穿透血脑屏障的能力较强。本研究将狂犬病病毒主要保护性抗原G蛋白基因重组至9型腺相关病毒,获得重组腺相关病毒rAAV9-GFP-RABVG。通过体外细胞实验、动物免疫及攻毒保护实验,分析G蛋白表达情况,评价其免疫原性和保护性。目的1.采用9型腺相关病毒作为载体,插入狂犬病病毒SRV9毒株G蛋白基因,构建表达狂犬病病毒G蛋白的重组腺相关病毒rAAV9-GFP-RABVG。2.通过体外细胞实验检测rAAV9-GFP-RABVG在细胞水平上能否表达RABV G蛋白;通过动物免疫实验检测rAAV9-GFP-RABVG的免疫原性和保护性,为新型重组狂犬病疫苗的研制提供科学依据。方法1.构建表达狂犬病病毒G蛋白的9型腺相关病毒载体重组病毒rAAV9-GFP-RABVG,体外感染293T细胞,通过间接免疫荧光实验和Western blot检测狂犬病病毒G蛋白的表达情况。2.6-8周龄雌性BALB/c小鼠后肢骨骼肌注射rAAV9-GFP-RABVG,监测小鼠体重、饮食、毛色状态,持续21天,通过小鼠体重变化及小鼠状态初步评价重组病毒疫苗的安全性。3.6-8周龄雌性BALB/c小鼠后肢骨骼肌注射rAAV9-GFP-RABVG,在免疫后第2、4、8、12、24周采血,分离外周血清,利用荧光抗体病毒中和试验(FAVN)检测病毒中和抗体(VNA)效价,获得中和抗体的持续期和消长变化规律。4.通过流式细胞术检测rAAV9-GFP-RABVG诱导小鼠募集和/或活化B、T、DCs细胞的情况。5.使用ELISpot检测试剂盒检测特异性刺激物存在时rAAV9-GFP-RABVG诱导小鼠脾细胞分泌细胞因子IFN-y和IL-4的能力。6.使用ELISA试剂盒检测特异性刺激物存在时rAAV9-GFP-RABVG诱导小鼠脾细胞分泌IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的水平。7.攻毒保护实验。6-8周龄雌性BALB/c小鼠后肢骨骼肌注射rAAV9-GFP-RABVG后21天,异侧后肢骨骼肌注射HuPBN3株狂犬病病毒,记录攻毒后21天内小鼠状态及死亡情况,取死亡小鼠脑组织进行RT-PCR,检测rAAV9-GFP-RABVG能否保护小鼠免于狂犬病病毒致死剂量的攻击。结果1.间接免疫荧光及Western blot实验检测到狂犬病病毒G蛋白在细胞水平上的表达,且分子量约为70kD,与预期大小相符。2.与空白组和AAV9-GFP对照组相比,rAAV9-GFP-RABVG重组病毒组小鼠体重变化轻微,未出现异常行为或神经症状。3.对免疫小鼠血清中和抗体水平检测结果显示,与对照组AAV9-GFP相比,rAAV9-GFP-RABVG能诱导小鼠产生强烈的RABV中和抗体,免疫后2周达到13.66IU/ml,第8周达到峰值,且免疫后24周仍保持较高水平。4.流式细胞术结果显示,与空白组和AAV9-GFP对照组相比,rAAV9-GFP-RABVG能诱导小鼠募集和/活化更多的B细胞(CD19+CD40+双阳性)和DCs(CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、CD11c+MHC Ⅱ+双阳性)细胞,小鼠脾中抗原特异性分泌IFN-γ和IL-4的CD4+T细胞和抗原特异性分泌IFN-γ的CD88+细胞显著增多。5.IFN-γ ELISpot和IL-4 ELISpot检测结果趋势相似,与空白组和AAV9-GFP对照组相比,rAAV9-GFP-RABVG刺激小鼠脾淋巴细胞产生的斑点形成细胞(SFCs)数目显著增多。6.ElISA结果显示,与空白组和AAV9-GFP对照组相比,rAAV9-GFP-RABVG诱导小鼠脾细胞抗原特异性分泌的IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ显著增多。7.攻毒保护实验结果显示,攻毒后观察期结束时空白组及AAV-GFP对照组的小鼠出现典型狂犬病症状,且存活率均为0%。rAAV9-GFP-RABVG重组病毒组小鼠观察期内未出现任何狂犬病症状,观察期结束时组内小鼠存活率为100%。空白组和AAV9-GFP对照组死亡小鼠脑组织的RT-PCR结果显示,死亡小鼠死于狂犬病。结论1.成功构建了表达狂犬病病毒G蛋白的重组腺相关病毒rAAV9-GFP-RABVG。2.rAAV9-GFP-RABVG在小鼠体内可触发针对狂犬病病毒的特异性免疫应答,诱导产生强烈的体液和细胞免疫反应,为小鼠提供了完全保护力抵抗狂犬病病毒致死性的攻击,证明该重组病毒具有新型狂犬病候选疫苗的潜力。
【图文】：

质粒载体,重组病毒,反应体系,重组质粒

图１邋ｒＡＡＶ９－ＧＦＰ－ＲＡＢＶＧ质粒构建图逡逑将目的基因ＲＡＢＶＧ插入到Ｖｉｇｅｎｅｂｉｏ的腺相关病毒质粒载体ｐＡＶ－ＣＭＶ－逡逑Ｐ２Ａ－ＧＦＰ邋ＡＡＶ的两个酶切位点Ｉ和Ｍ／ｗ邋Ｉ之间（图１），进行重组病毒质逡逑粒的构建克隆。逡逑２．逦ｒＡＡＶ９－ＧＦＰ－ＲＡＢＶＧ目的基因鉴定：逡逑（１）双酶切反应体系：逡逑重组质粒逡逑Ａｓｉｓ邋Ｉ逦ｌ＾ｉｌ逡逑２９逡逑

质粒,后产物,病毒,荧光

、ＲＡＢＶＧ基因在重组腺相关病毒感染性克隆质粒的检测逡逑将构建的重组感染性克隆质粒ｒＡＡＶ９－ＧＦＰ－ＲＡＢＶＧ用Ａｙｋ邋Ｉ和Ｍｗ邋Ｉ内切逡逑酶进行双酶切鉴定。双酶切结果如图３所示，在５，３５０ｂｐ和ｌ，５７５ｂｐ处有两条明逡逑显条带，上方一条为ｐＡＶ－ＣＭＶ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ邋（５，３５０ｂｐ），下方一条为插入ＳＲＶ９－逡逑Ｇ片段（ｌ，５７５ｂｐ），与预期大小相符。测序结果证实为ＳＲＶ９－Ｇ，证明成功构逡逑建表达ＲＡＢＶ－Ｇ基因的ｒＡＡＶ９－ＧＦＰ－ＲＡＢＶＧ感染性克隆质粒。逡逑ｂｐ邋Ｍ邋１逡逑１００００逡逑７０００逡逑４０００邋Ｐ＞＾ａ－５３５0ｂＰ逡逑２０００逡逑Ｓｊｊ＾ａ？．逦１５７５ｂｐ逡逑１０００逡逑ｍＭ逡逑２５°ＤＩ逡逑图３邋ｒＡＡＶ９－ＧＦＰ－ＲＡＢＶＧ质粒的双酶切鉴走逡逑Ｍ：邋ＤＬ１００００邋ＤＭＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１：邋ｒＡＡＶ９－ＧＦＰ－ＲＡＢＶＧ邋质粒双酶切后产物。逡逑二、ＧＦＰ蛋白及ＲＡＢＶＧ蛋白表达检测逡逑１．逦ＧＦＰ蛋白荧光观察结果：将ｒＡＡＶ９－ＧＦＰ病毒（滴度：２．０ｘｌ０ｌ３ｖ．ｇ．／ｍｌ），逡逑ｒＡＡＶ９－ＧＦＰ－ＲＡＢＶＧ邋重组病毒（滴度：２．0ｘｌ0ｌ３ｖ．ｇ．／ｍｌ）接种邋２９３Ｔ邋细胞，逡逑空白组不接种病毒，７２ｈ后直接在倒置荧光显微镜下观察。结果显示，在逡逑ｒＡＡＶ９－ＧＦＰ病毒和ｒＡＡＶ９－ＧＦＰ－ＲＡＢＶＧ重组病毒感染的２９３Ｔ细胞中观察逡逑到明显的荧光，ＧＦＰ蛋白表达较强，空白组未观察到荧光（图４）。逡逑２．
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373

【参考文献】