人真皮微血管内皮细胞功能性表达IFNLR1的研究

发布时间：2020-06-06 07:58

【摘要】：目的:IL-29相较于I型干扰素其副作用更低,且同样具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等作用,但因其特异性受体IFNLR1呈选择性分布,故IL-29的临床应用范围受限。本研究旨在验证人真皮微血管内皮细胞(HDMEC)上是否表达IL-29的特异性受体IFNLR1,以及探索IL-29与IFNLR1结合后在HDMEC细胞上所发挥的生物学作用。为IL-29的临床应用提供新的实验依据。方法:(1)选取HDMEC细胞培养,应用实时荧光定量PCR技术检测HDMEC细胞上特异性受体IFNLR1的m RNA水平;应用western blot和免疫荧光技术检测受体IFNLR1蛋白表达水平。(2)HDMEC细胞分为四组:(1)空白对照组(2)重组IL-29刺激组(3)应用IFNLR1单克隆抗体封闭+重组IL-29刺激组(4)IFNLR1单克隆抗体的同源抗体Ig G+重组IL-29对照组。各组处理0.5小时、1小时及2小时后,ELISA检测细胞因子IL-8和IL-12分泌水平。(3)DENV作用于HDMEC细胞,ELISA方法检测24小时、48小时及72小时IL-29分泌量。(4)HDMEC细胞分为四组:(1)空白对照组(2)IFNLR1单克隆抗体封闭+DENV组(3)DENV组(4)IFNLR1单克隆抗体同源抗体Ig G+DENV组。通过Transwell建立单层HDMEC细胞模型,检测各组HRP渗透到下室的OD值,以反映HDMEC细胞通透性。应用pull-down实验检测在DENV作用后,IFNLR1受体封闭前后Rho A的活化情况。结果:(1)通过real-time PCR技术从基因水平上检测到HDMEC细胞表达IFNLR1,表达量为1.00±0.285;western blot和免疫荧光技术从蛋白水平证实HDMEC细胞表达IFNLR1。(2)IL-8在HDMEC细胞上有基础分泌,在0.5小时、1小时、2小时分泌量分别为26.494±5.373pg/ml、33.60917±9.671 pg/ml、45.035±5.658 pg/ml;在重组IL-29刺激下,IL-8分泌量较空白组有所增加,在0.5小时、1小时、2小时分泌量分别为72.759±1.825 pg/ml、175.402±20.731 pg/ml、278.736±19.559 pg/ml;在封闭了IL-29特异性受体IFNLR1后再给予IL-29刺激,IL-8分泌量明显降低,在0.5小时、1小时、2小时分泌量分别为24.368±2.296 pg/ml、26.50574±12.232 pg/ml、32.36780±22.967 pg/ml;IFNLR1同源抗体Ig G组IL-8分泌量与仅IL-29处理组无明显差异。HDMEC细胞在各组处理条件下,IL-12分泌量极低。(3)DENV作用后可以诱导HDMEC细胞分泌IL-29,在24小时、48小时、72小时分泌量分别为90.205±1.601pg/ml、179.949±13.241 pg/ml、153.821±5.356 pg/ml。(4)DENV作用于HDMEC细胞引起细胞通透性增加;封闭IFNLR1受体使HDMEC细胞通透性增加较仅DENV作用组更加明显,在DENV作用后48小时通透性最大。(5)DENV作用于HDMEC细胞,可以使Rho A活化,Rho A活性增加;IFNLR1封闭后DENV引起Rho A活化量最多,Rho A活性最高。结论:(1)证实人真皮微血管内皮细胞上IFNLR1表达;(2)IL-29与其特异性受体IFNLR1结合后能够调节细胞因子IL-8的分泌,但不能诱导和调节IL-12的分泌;(3)DENV感染HDMEC后诱导IL-29分泌,IL-29与特异性受体IFNLR1结合后对Rho A的活性有影响,Rho A的活性可能对血管通透性产生一定影响。
【图文】：

抗肿瘤及免疫调节作用；而结构上与 IL-10 家族成员相似。虽然Ⅰ型和Ⅲ型干扰素在基因表达和信号通路上基本相同，但是这两种干扰素却是通过完全不同的干扰素受体来发挥作用。干扰素家族受体，一般作为异物二聚体的形式存在。干扰素家族受体有 R1 和 R2 两个受体链，R1 受体链的特异性较强是因为它结构域长，可以磷酸化，并且征集各类化学分子，从而决定细胞因子的特异性。相对而言 R2 受体链就没有特异性，因为它的结构域短，，只能征集其他酪氨酸残基到受体复合物上，从而对信号转导起到一定的支持作用[3-5]。Ⅲ 型 干 扰 素 的 异 物二 聚 体 型 受 体 由 干扰 素 λ 受 体 1 （ Interferon λReceptor1,IFNLR1）的R1型受体链和白介素10R2受体（Interleukin-10 Receptor2IL10R2）的R2型受体链组成（图1），主要由特异性受体IFNLR1发挥生物学效应IL10R2，同时也是IL-10、IL-22和IL-26的R2型受体链[1]。

EC 细胞上 IFNLR1 mRNA 相对表达量用RT-qPCR 方法检测两个细胞株 HDMEC 和HepG2上 I结果如下表 1.1。HDMEC 细胞和 HepG2 细胞上 IFNLR1.00±0.285 和 9.14±0.36，HDMEC 上的表达量显著低于 Hep表 1.1，图 1.1）表 1.1 HDMEC、HepG2 细胞上 IFNLR1mRNA 相对表达量细胞 IFNLR1 mRNA 相对表HDMEC 1.00±0.285HepG2 9.14±0.36**注：n=3， X±SD， **表示与 HepG2 相比，p<0.01**
【学位授予单位】：海南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

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本文编号：2699390