抗嗜铬粒蛋白A单克隆抗体的制备及其在免疫组化中的应用

发布时间：2020-06-07 06:23

【摘要】：嗜铬粒蛋白A(Chromogranin A,CgA)是一种可溶性神经内分泌酸性蛋白,分子量约为49 kDa。CgA广泛存在于神经内分泌系统中,主要由神经内分泌细胞和其他组织内分泌细胞表达分泌。研究表明,在神经内分泌肿瘤组织中,CgA的表达含量明显高于相应的正常组织,因此,CgA成为临床上神经内分泌肿瘤检测的重要标志物。研究和制备识别CgA特定表位的高亲和力抗体可以为临床诊断和科学研究提供有价值的服务。本研究将人CgA编码基因序列进行密码子优化,然后将优化后的CgA基因克隆到原核表达载体pET28a上。通过大肠杆菌BL21(DE3)原核表达系统表达CgA融合蛋白,接着通过亲和层析纯化获得CgA-His重组蛋白。将纯化后的CgA-His6蛋白作为免疫原,免疫5周龄BALB/c小鼠,刺激小鼠产生CgA抗体。当小鼠血清的抗体滴度超过1:8000时,利用杂交瘤技术将小鼠B细胞与骨髓瘤细胞融合制备分泌抗体的杂交瘤细胞;通过CgA抗原筛选,最终获得一株稳定分泌CgA抗体的细胞株4E5。通过实验鉴定,杂交瘤细胞株4E5的染色体数目为102±4,分泌的抗体类型为IgG2b。利用亲和层析方法从接种过细胞株的小鼠腹水纯化获得CgA单克隆抗体,iELISA和Western blot实验表明4E5抗体具有很强的特异性。通过IHC实验分析表明,4E5抗体可以特异性识别非小细胞肺癌、胰岛细胞癌以及肾上腺素组织中CgA的表达,识别CgA的灵敏度比鼠抗LK2H10+PHE5和兔抗SP12的染色效果更好。对4E5抗体做进一步鉴定,结果表明抗体效价为5.12×105,亲和力为9.23×109L/mol。同时IHC实验表明,4E5抗体在4℃或37℃条件下处理50 d,仍具有很强的抗体活性,表明4E5抗体具有很强的稳定性。为了进一步研究4E5特异识别的序列,将CgA的编码序列在大肠杆菌中进行分段表达,然后通过Western Blot方法与CgA的不同肽段进行杂交。实验结果表明4E5抗体特异识别CgA111-220肽段。本研究为设计生产具有自主知识产权并可用于IHC的CgA抗体提供了方法学参考,并且所获得的CgA高亲和力抗体和实验数据将为临床诊断提供有价值的选择和参考。
【图文】：

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【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

【参考文献】

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1 李佳;齐军;;小细胞肺癌相关肿瘤标志物的研究进展[J];标记免疫分析与临床;2015年12期

2 谢明;张丹;任国胜;;嗜铬粒蛋白A及其衍生多肽在天然免疫系统中的作用[J];医学综述;2013年06期

3 张卫琴;;免疫组化技术在病理诊断中的应用[J];安徽医药;2012年11期

4 王红群;王庆梅;蒋毅;汤e

本文编号：2700993