布鲁氏菌P39抗原糖基化与非糖基化免疫原性差异的分析

发布时间：2020-06-07 23:56

【摘要】：布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌引起的一种人兽共患的传染病,在世界各地都广泛流行,在发展中国家尤为严重。目前,控制布鲁氏菌病的主要手段是检出捕杀和免疫动物,然而尚无有效的商品化人用疫苗,而动物疫苗多为弱毒苗,具有一定的毒性和致病力,难与自然感染区分开。因此,开发安全有效的疫苗是控制布病的主要研究内容。P39蛋白是羊布鲁氏菌免疫保护候选抗原蛋白,本文以毕赤酵母为宿主表达P39蛋白,对其进行糖基化修饰,探讨其糖基化修饰对重组蛋白免疫原性的影响,为布鲁氏菌新型疫苗的研制奠定基础。方法:对布鲁氏菌优势抗原蛋白P39基因进行克隆,并构建真核表达载体pPICZαA-P39,电转化法转化GS115感受态细胞,Zeocin抗性筛选高拷贝数转化子,优化重组蛋白的表达条件,通过亲和层析方法对目的蛋白进行纯化,分子筛进一步纯化,BCA法检测蛋白浓度,液相色谱法检测其纯度,Western blot免疫印迹法对目的蛋白进行鉴定。利用PNGaseF糖苷酶对重组蛋白进行N端糖链的释放,PAS糖原进行染色,并利用核磁共振氢谱对重组蛋白的糖基化修饰进行分析,确定其糖基化程度。通过巨噬细胞对糖基化蛋白的吞噬作用研究糖基化后的蛋白对细胞识别的影响,通过免疫小鼠实验,检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平、细胞因子分泌水平、IgG特异性抗体水平等实验研究其免疫原性的变化。通过Western Blot检测细胞表面受体TLR-2、MyD88、TRAF6、TLR-4表达情况,探讨蛋白糖基化修饰对免疫信号分子的影响及糖基化影响免疫原性的机制。结果:1.对P39抗原蛋白在毕赤酵母中分泌表达,优化发酵条件发现在pH 6、甲醇诱导浓度为1%、磷酸盐浓度为0.02 M的条件下,诱导时间72h可获得蛋白5.05g/L。亲和层析法对目的蛋白进行纯化,高效液相检测纯化后蛋白纯度可达93.77%。Western blot免疫印迹法对目的蛋白进行鉴定,确定其分子量为45 kDa,与P39抗原蛋白相符。2.利用PNGaseF糖苷酶对重组P39蛋白进行水解,结合核磁共振氢谱结果表明,毕赤酵母表达的P39抗原蛋白被糖基化修饰,且糖基化修饰类型为O-糖基化。3.将毕赤酵母表达的重组蛋白免疫小鼠,MTT法检测脾淋巴细胞增殖结果发现,重组P39蛋白和原核P39蛋白均可显著促进脾淋巴细胞的增殖,但重组后的P39蛋白促脾淋巴细胞增殖的作用明显高于原核P39蛋白。检测小鼠血液中特异性IgG抗体变化发现,在免疫小鼠4-6周的时间内均能检测到较高水平的抗体IgG,真核表达的P39蛋白IgG抗体表达水平在5周时能达到峰值,且峰值略高于原核P39蛋白。通过检测细胞上清中细胞因子的分泌水平结果发现,重组的P39蛋白刺激细胞产生IFN-γ、IL-2细胞因子的水平高于原核蛋白组,说明重组的P39蛋白可能会更好的激活Th1型细胞免疫水平。4.巨噬细胞吞噬荧光标记的重组蛋白和原核蛋白,结果表明巨噬细胞对重组P39蛋白的捕获吞噬作用明显,且用时较短,说明重组的P39蛋白更易被巨噬细胞识别捕获。上述结果说明糖基化修饰后的蛋白其免疫原性明显高于未修饰蛋白。Western Blot检测细胞表面各类受体表达结果表明,毕赤酵母重组的P39蛋白与原核表达的P39蛋白均可引发细胞表面受体TLR-2、TRAF6、TLR-4表达,相对原核P39蛋白,糖基化蛋白可提高TLR-4受体及TRAF6信号分子的表达,说明糖基化的修饰后的蛋白可诱发机体产生部分天然免疫,可能是通过TLR-4受体,调节TRAF6信号途径。结论:通过对小鼠免疫原性的初步探索,研究发现真核P39蛋白和原核P39蛋白都可以刺激机体产生较强的免疫反应,能分泌大量的IFN-γ细胞因子,有效促进细胞免疫水平,脾淋巴细胞增殖实验发现糖基化修饰后的P39蛋白能显著促进淋巴细胞的增殖,且糖基化修饰的蛋白免疫后的小鼠抗体水平以及细胞因子水平均高于原核P39蛋白,糖基化修饰能提高P39蛋白的免疫保护力,可能是诱导了TLR-4受体信号途径,增强天然免疫水平。这为糖修饰P39蛋白作为布鲁氏菌疫苗候选抗原奠定了实验基础。
【图文】：

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图 1.酵母糖基化修饰类型及人源改造类型[52]注：a.酿酒酵母和巴斯德酵母的 N-连接聚糖结构，Man8GlcNAc2 核心结构，进入高体后通过分泌途径产生高甘露糖基化，，通过 α-，β-和磷酸-甘露糖进行延伸；b.N-端高糖基化结构改造为唾液酸化双触角结构，可用于人类治疗糖型；c.酿酒酵母和巴斯德酵发现的天然 O-端糖基化结构；d.改造后的 O-端聚糖结构为哺乳动物糖型的代表结构，别为：O-岩藻糖基化（i）、粘蛋白型（ii）和糖甙类型（iii）糖型。Fig.1 Yeast glycosylation modification type and Human convertion typeNote: (a).N-linked glycan structure for S. cerevisiae and P. pastoris is depicted.This iscomposed of the common Man8GlcNAc2 core structurethat enters the Golgi, and which issubsequently extended with α-, β-, and phospho-mannose as it passes through the secretoryathway to produce a hypermannosylated structure.(b).Through N-linked glycan engineering thypermannosylated structure has been converted to a sialylated bi-antennary structure, which representative of a human glycoform desirable for therapeutic applications.(c). Native O-linkeglycosylation found in both S. cerevisiae and P. pastoris.(d).Through glycan engineering this heen converted into O-linked glycan structures representative of mammalian glycoforms, inclu

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果正确的重组质粒进行测序，将测序结果翻译后与 GENBANK 中记录的 P39 基因的氨基酸序列比对，结果完全一致。图1.1 布鲁氏菌基因组中P39基因的PCR电泳结果M：DL2000 DNA分子量标准；1：P39 PCR产物Fig.1.1 The electrophoresis result of PCR product of Brucella genomeM：DL2000 DNA Marker；1：PCR product of P39图1-2 重组质粒pMD19T-P39的双酶切电泳结果M：DL5000 DNA分子量标准；1：pMD19T-P39 双酶切产物
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392;S852.4

【参考文献】