复苏后人孤雌胚胎干细胞传代培养鉴定及向视网膜色素上皮分化的初步研究

发布时间：2020-06-12 09:10

【摘要】：胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境,胚胎干细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。处于MⅡ期卵母细胞在某些理化因素的刺激下,不经过精子受精作用,在保持二倍体状态下发生有丝分裂获得的早期胚胎发育过程称为孤雌激活。卵母细胞孤雌激活后获得的囊胚称为孤雌囊胚,分离孤雌囊胚ICM建立胚胎干细胞系称为孤雌胚胎干细胞(parthenogenetic embryonic stem cells, PESCs)系。孤雌胚胎干细胞与胚胎干细胞一样具有分化潜能,而且哺乳动物孤雌胚胎源于单配子,不能发育为个体,因此利用人孤雌胚胎干细胞进行实验不仅为干细胞研究提供了崭新的实验来源,还避免了诸多伦理问题。视网膜色素上皮(retinal pigmented epithelium,RPE)细胞位于神经视网膜和脉络膜之间,成为血视网膜屏障的外层,控制着视网膜下间隙的化学成分,通过提供营养和代谢废物来滋养视网膜。RPE细胞的异常增殖、结构破坏、功能丧失,可导致许多视网膜疾病,近年文献报道人胚胎干细胞诱导分化的RPE细胞作为细胞移植供体来源有众多优势,其细胞形态、基因表达和免疫组织学特征与ARPE-19即人RPE组织来源建立的细胞系相比更接近人RPE细胞,并且具备吞噬功能,在动物实验中已显示改善视功能的疗效。本实验中采用完全人来源培养体系建立的人孤雌胚胎干细胞系,初步探讨了hPESCs稳定传代与鉴定,并经细胞因子诱导形成RPE细胞的相关内容,分化形成的RPE细胞同卵子提供者具有相同的基因型,用于视网膜再生治疗完全没有排斥反应,同时也证实了人孤雌胚胎干细胞同正常受精来源的人胚胎干细胞系具有同样的诱导分化潜能,为孤雌干细胞的临床治疗提供实验基础,也为今后的再生治疗应用于临床提供细胞来源和理论基础。目的：解冻复苏已建立的稳定传代的人孤雌胚胎干细胞系,诱导hPESCs向RPE细胞分化,纯化后的色素细胞通过免疫组化分析,与人胎儿RPE细胞对比,证实复苏后建立的hPESCs系同样具有稳定传代及高效的诱导分化潜能。对象和方法：利用天津市中心妇产科医院生殖医学中心已成功建立的人孤雌胚胎干细胞系,解冻复苏第16及第18代hPESC,应用人包皮成纤维细胞作为饲养层,使用加入80%KnockOut DMEM、20%KnockOut血清替代物、2mML-谷氨酰胺、0.1mMβ巯基乙醇、8ng/mlbFGF等的hPESCs培养基,建立人孤雌胚胎干细胞系并稳定传代,并且对其特异性标志物SSEA-3、SSEA-4、SSEA-1、 TRA-1-60、TRA-1-81、转录因子Oct-4,碱性磷酸酶,体内或体外分化能力作全面的鉴定。最后,通过hPESCs扩增、分化色素上皮细胞、丰富扩增色素上皮细胞和向视网膜色素上皮细胞分化四步诱导其向RPE细胞分化,并对分化各阶段细胞进行免疫组化染色,了解诱导分化的效果。结果：利用本实验室建立的人孤雌胚胎干细胞培养方法和改良的同源性培养体系,复苏后的人孤雌胚胎干细胞hPESCs-100616及hPESCs-100618体外长期扩增均超过5代,经鉴定分别保持人孤雌胚胎干细胞的特性,表现了良好的增殖与自我更新特性。向视网膜色素上皮分化过程中,在加入bFGF因子培养基中,3-4周hPESCs可形成色素细胞,继续培养2-3周后可以形成多边形的色素细胞簇,4-6周后棕黑色色素颗粒可以延伸到细胞簇边缘部。无bFGF因子诱导的自发分化培养亦可以获得与之相类似的结果。该现象与人胎儿视网膜色素上皮色素沉积过程一致。上皮形态与色素表达均提示,该细胞为人孤雌胚胎干细胞来源的RPE细胞。结论：已经建立的人包皮成纤维细胞饲养层(human foreskin fibroblasts,HFF)与hPESCs培养体系完全适用于解冻复苏后的hPESCs,可以维持hPESCs保持高度增殖及不发生自发分化的特性。利用细胞因子诱导hPESCs向视网膜色素上皮分化的过程达到预期目的,证实了bFGF有对神经前体细胞增殖分化的作用,未加细胞因子的自发分化组同样有部分细胞分化为RPE细胞,但色素颗粒较前组少,分化效率较低。两种分化方法均可达到预期目的,考虑经济、效率等综合问题,究竟哪种方法更适合临床应用还需要继续探索。实验最后获得大量RPE细胞,为视网膜色素上皮细胞用于临床研究提供了更新更安全的细胞来源和理论基础。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329.2

【参考文献】