纳米脂质体递送TTF-1启动子调控miR-7真核表达载体对人肺癌裸鼠模型肿瘤生长的影响

发布时间：2020-06-13 21:27

【摘要】：本课题研究包括两部分内容,第一部分为:TTF-1启动子调控mi R-7真核表达载体纳米脂质体的制备;第二部分为:纳米脂质体递送TTF-1启动子调控mi R-7真核表达载体对人肺癌模型肿瘤体内生长的影响。分述如下:目的:第一部分:构建TTF-1启动子调控miR-7真核表达载体,并用薄膜分散法制备miR-7真核表达载体纳米脂质体。第二部分:常规建立人肺癌裸鼠模型,使用HE染色、实时荧光定量PCR、Western Blot、免疫荧光(Ki-67、TUNEL)等实验方法观察纳米脂质体递送TTF-1启动子调控miR-7真核表达载体对人肺癌裸鼠模型肿瘤生长的影响;同时初步评估其体内安全性。方法:第一部分:利用分子生物学技术构建TTF-1启动子调控miR-7真核表达载体;使用薄膜分散法制备包裹miR-7真核表达载体的纳米脂质体;利用透射电镜、激光粒度及Zeta电位分析仪检测其外观、粒径、zeta电位、多分散指数PDI,利用透析法检测其包封率和稳定性。第二部分:使用人肺癌95D细胞建立人肺癌裸鼠模型(每组各6只);模型建立成功后分别通过裸鼠尾静脉注射包裹100μg p-T-miR-7真核表达载体的纳米脂质体和包裹100μg p-T载体的纳米脂质体,随后每3天注射一次,并于每次注射前测量计算肿瘤体积,动态监测模型小鼠肿瘤体积变化,连续注射3次,且于末次注射3天后将小鼠麻醉处死;分别取p-T-miR-7纳米脂质体组和p-T纳米脂质体组的肿瘤组织和肺脏组织,HE染色观察组织病理学改变;Real-time PCR和荧光共聚焦技术检测p-T-miR-7载体在肿瘤组织的表达情况,以及两组小鼠肿瘤组织中肿瘤生长相关因子CDK2、CDK3、CDK4和CDK6和肿瘤转移相关因子MMP-2、MMP-9、E-cadherin和CXCR4的表达变化;随后观察两组肿瘤组织中增殖核抗原Ki-67的表达情况,以及TUNEL法观察两组肿瘤组织中肿瘤细胞的凋亡水平;Western blot检测信号通路p-Akt,p-Erk以及靶分子NDUFA-4的表达变化;分析荷瘤小鼠主要脏器的HE染色、脏器重量、脏器指数和血糖、血脂等生化指标变化,并用实时荧光定量PCR检测小鼠主要脏器的mi R-7表达水平和p-T-miR-7载体质粒拷贝数分布情况以初步评估p-T-miR-7纳米脂质体体内治疗的安全性。结果:第一部分:首先分别成功构建TTF-1启动子调控miR-7真核表达载体(pEGFP-N1-TTF-1-miR-7,命名为p-T-miR-7)和TTF-1启动子真核表达载体(pEGFP-N1-TTF-1,命名为p-T)。随后使用薄膜分散法分别制备包裹p-T-miR-7载体的p-T-miR-7纳米脂质体和包裹p-T载体的p-T纳米脂质体。利用透射电镜、激光粒度及Zeta电位分析仪分别检测其外观、粒径、zeta电位、多分散指数PDI,结果显示:两种纳米脂质体外观呈球形或近球形;p-T-miR-7纳米脂质体平均粒径为72.15 nm、zeta电位为-3.15mV、PDI指数为0.258,p-T纳米脂质体平均粒径为78.10 nm、zeta电位为-18.88mV、PDI指数为0.255;使用透析法检测其包封率,结果显示:p-T-miR-7纳米脂质体包封率为67%、p-T纳米脂质体包封率为64%,且包封率稳定。第二部分:观察人肺癌裸鼠荷瘤模型肿瘤动态生长情况,统计分析肿瘤体积变化,结果显示:p-T-miR-7纳米脂质体实验组相比于p-T纳米脂质体对照组,肿瘤生长速度明显减缓(P0.05);对人肺癌裸鼠荷瘤模型肺脏组织和肿瘤组织做石蜡切片HE染色观察可见:肺脏组织中相比于p-T对照组镜下观察到明显肺转移,p-T-miR-7实验组则无明显肺转移灶;肿瘤组织中相比于p-T对照组,p-T-miR-7实验组镜下可见大面积肿瘤坏死区域;Real-time PCR结果发现:相比于p-T对照组,p-T-miR-7实验组中miR-7的表达水平明显升高(P0.01);荧光共聚焦显微镜观察发现p-T-miR-7组肿瘤组织中有大量EGFP蛋白表达;同时,p-T-miR-7实验组肿瘤组织中肿瘤生长相关因子CDK2、CDK3、CDK4和CDK6以及肿瘤转移相关因子MMP-2、MMP-9、E-cadherin、CXCR4的表达均显著降低,具有统计学差异(P0.05);相比于p-T对照组,p-T-miR-7实验组肿瘤组织中增殖核抗原Ki-67表达水平明显降低(P0.05),TUNEL法则显示:相比于p-T对照组,p-T-miR-7实验组肿瘤组织中细胞凋亡明显增加;Western blot检测肿瘤组织中信号通路变化发现:相比于p-T对照组,p-T-miR-7实验组的p-Akt、p-Erk以及靶分子NDUFA-4蛋白表达水平明显下调,具有统计学差异(P0.05);对纳米脂质体递送TTF-1启动子调控miR-7真核表达载体在体内的分布和安全性检测结果显示:p-T-mi R-7实验组与p-T对照组相比,小鼠主要脏器:心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑组织、小肠、淋巴结的形态学与病理生理学均无明显差异,且脏器重量和脏器指数也无明显差异(P0.05);同时,两组小鼠相关生化指标TC、TG、GLU、AST和ALT均无明显差异(P0.05);最后,小鼠主要脏器中肺脏p-T-miR-7质粒拷贝数分布水平明显高于其他脏器,提示纳米脂质体可在肺脏中富集。结论:第一部分:利用薄膜分散法成功制备TTF-1启动子调控miR-7真核表达载体的纳米脂质体;第二部分:纳米脂质体递送TTF-1启动子调控miR-7真核表达载体可显著抑制人肺癌裸鼠模型肿瘤的生长。
【图文】：

纳米脂质体,包封率

zeta 电位分别为-3.15 mV 和-18.88 mV（如图1-3 所示）。图 1-3 纳米脂质体 Zeta 电位Fig.1-3 The zeta potential of nanoliposomes.Weighted all samples (Soya lecithin : cholesterol = 4:1, mass ratio) into an eggplant-flask, added 6 mLchloroform. Solution was concentrated under reduced pressure to remove all chloroform. After that, 3 mL PBS（Contained P-T or P-T-miR-7）were added and eluted with glass balls until the nanoliposomes separated fromeggplant-flask completely. Finally, nanoliposomes was obtained after sonication for 50 minutes. The zeta potentialof P-T nanoliposome and P-T-miR-7 nanoliposomes.3.2.3 纳米脂质体包封率分别利用透析法测定最优化条件制备的 P-T-miR-7 纳米脂质体和 P-T 纳米脂质体包封率，检测发现：P-T-miR-7 纳米脂质体包封率为 67%，，P-T 纳米脂质体

纳米脂质体,稳定性,包封率

纳米脂质体包封率 The entrapment efficiency of nanoliposomes.d all samples (Soya lecithin : cholesterol = 4:1, mass ratio) into an eggplant-flaskrm. Solution was concentrated under reduced pressure to remove all chloroform. Afterined P-T or P-T-miR-7）were added and eluted with glass balls until the nanoliposome-flask completely. Finally, nanoliposomes was obtained after sonication for 50 minutesy of nanoliposomes was detected by dialysis method.米脂质体稳定性别于制备后不同时间点，即 0 天、14 天、28 天、60 天，利用条件制备的 P-T-miR-7 纳米脂质体和 P-T 纳米脂质体包封率，-T-miR-7 纳米脂质体还是 P-T 纳米脂质体均具有良好稳定性（
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2;R-332

【参考文献】