大型真菌蛋白研究及应用

发布时间：2020-06-22 15:28

【摘要】：第一部分：北虫草菌丝、子实体的转录组和蛋白组分析 冬虫夏草(Cordyceps sinensis)是中国传统的药用真菌,是寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体,许多研究证明其有抗肿瘤和免疫调节等生理作用。天然的虫草稀少且昂贵,资源也日益枯竭。北虫草(Cordyceps militaris)是虫草属的另一种虫、菌结合的药用真菌,活性成分与冬虫夏草类似,其己经被成功的进行了人工栽培并作为天然虫草的替代品被广泛接受。但是除了虫草素、虫草酸和虫草多糖等常见的活性组分,对北虫草中其他药用组分特别是蛋白组分的研究较少。本研究从转录和翻译水平对不同发育阶段的人工培养北虫草进行了系统的分子学研究,以期待发现活性蛋白质／多肽成分。 我们对人工培养的北虫草的菌丝及子实体进行了高通量的Illumina测序并进行转录组数据分析。将得到的clean reads与己知的北虫草基因组进行比对并进行序列随机性评估和覆盖率统计,结果显示约有90%的clean reads能比对到北虫草基因组上,且reads在基因个部位的分布均匀,基因覆盖率大于90%,表明测序以及比对结果都较好。我们预测了共738个可变剪接事件以及不同时期的约3000个新的转录本,该预测丰富了北虫草的数据库。对北虫草不同发育时期基因表达差异分析表明,共有2113个基因在菌丝时期高表达,有599个在子实体时期高表达。将这些差异表达基因进行功能注释分析(GO, KEGG),发现与细胞内核酸结合及代谢、转录调控等活动在菌丝时期较为活跃：而糖水化合物代谢,信号转导等活动在子实体时期更为活跃。这都与北虫草的发育需要相关。另外,我们通过对预测的虫草素代谢途径进行深入分析证明菌丝时期此代谢途径更为活跃,这为虫草素的生产优化提供了数据支持。 我们利用一维凝胶电泳技术、高效液相色谱与质谱结合技术对北虫草的菌丝及子实体进行了蛋白质组的测序。在菌丝和子实体中分别鉴定了359和214个蛋白,进行功能注释分析(GO, KEGG, COG)后发现与转录组相似的规律,验证了转录组数据。另外,我们分析了其中值得关注的一些蛋白质,包括凝集素,超氧化物歧化酶,与虫草素代谢途径相关的酶等,为进一步研究北虫草蛋白提供了重要数据信息。 根据北虫草蛋白组数据,我们从北虫草菌丝或是子实体中进行基因克隆后原核表达了三个蛋白质RicinB-related lectin (CCM_03832), ConA-like lectin (CCM_03227)和Superoxide dismutase (CCM_04979)o对它们进行生物活性分析,发现RicinB-related lectin (CCM_03832)有一定的凝血活性,RicinB-related lectin(CCM_03832)和ConA-like lectin (CCM_03227)能抑制HepG2细胞增殖,这三种蛋白都能刺激小鼠脾脏淋巴细胞的激活。 另外我们利用蛋白质分离技术从北虫草子实体中天然纯化了三种蛋白CM-1, CM-2, CM-3,并通过质谱技术在北虫草数据库中找到其对应序列,其生物活性也正在研究中。 第二部分：杨树菇凝集素2,AAL-2(Agrocybe aegerita Lectin2)用于富集O-GlcNAc修饰蛋白/肽段及其检测方法研究 O-GlcNAc修饰是非常重要的蛋白翻译后修饰,它与磷酸化,泛素化,甲基化等一系列蛋白修饰相互作用,共同调节细胞的各种生理活动并参与多种疾病的发生发展过程。但是O-GlcNAc修饰的富集与鉴定是该领域的瓶颈问题。 我们研究组从大型真菌杨树菇(Agrocybe aegerita)分离到一种新的凝集素AAL-2,通过糖谱鉴定发现其对GlcNAc具有极高的亲和力和特异性,要远远高于常用于O-GlcNAc修饰肽段富集的麦胚凝集素WGA。 本研究中我们用AAL-2分别对简单标准肽段样品以及一个具有O-GlcNAc修饰的阳性蛋白进行O-GlcNAc修饰肽段的富集,并通过MALDI-MS检测到了阳性肽段,证明AAL-2能有效富集简单样品中的O-GlcNAc修饰肽段。进一步,我们采用不同的层析方法对复杂样品的肽段和蛋白进行了富集分析：对复杂肽段(包括B16-BL6细胞质蛋白酶解肽段,糖尿病大鼠肝脏蛋白酶解肽段)进行富集,LC-MS/MS检测结果表明O-GlcNAc修饰肽段在穿透尾部富集；对复杂蛋白(正常及糖尿病大鼠肝脏蛋白)进行富集,western和LC-MS/MS (CID)结果均表明,O-GlcNAc修饰蛋白对Sepharose4B-AAL2有更高的亲和力,从而在洗脱峰中被富集。最后利用LC-MS/MS (ETD)技术从B16-BL6细胞质样品中鉴定到79个O-GlcNAc修饰蛋白(73个在穿透尾部检测到,9个在洗脱中检测到,其中有3个在两部分中均能检测到),共123个O-GlcNAc修饰位点(111个在穿透尾部检测到,13个在洗脱中检测到,其中有1个位点在两部分中均能检测到)。另外从糖尿病大鼠肝脏中检测到99个O-GlcNAc修饰蛋白,共119个修饰位点,从普通大鼠肝脏中检测到66个O-GlcNAc修饰蛋白,共82个修饰位点。这些结果还需要进一步的实验验证,本实验初步建立了AAL-2富集O-GlcNAc修饰蛋白／肽段的方法。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378;S567.35
【图文】：

法国农业科学研究院（French National Institute for Agricultural Research, INRA ),中国华大基因（BGI)等也陆续的启动了对大型真菌基因组的测序计划。图1-1列出了一些大型真菌和部分其他真菌的基因组测序年代表。部分其他真菌 大《真菌1996 ? 19962001 白色念 20012002 -— 2002I~衍箱械抱满{~ crassa)??. 新取！^球保(C.neoftVTP) , 2003 ? 以鬼><c.c杝 ? 2003I_ 构绝丨Hi 哲ntHulans)2004 ?— tt?孢说 ￡平?闲[P chrysosponum) —? 2004I 里氏木资(T-reesei)2005 米丨丨丨丨播 2005■烟丨丨fl 每{A fumigatus)2006 niger) —? 2006L 级"f；辑(7* virens)AS绿木笛（r.afrcmri州 《色姥科（t f)咖M 20072008 ?— 石舞样节皮闻("fl.肝pseum) —? 2008裂 Ww (S-coffimone)—-2009 「itiLfAM__tococcs> 服^ 2009‘ 洗W卧孔闲故金银耳(rmesemertca)~~lC：勤闲{S.hirsutum) ~|松牛?拟?孔满(F.pinicola)2010 ? W物内卞.阁（e.fesfucae) p,抱块闲(了TOtonosporu叫 _? 2010云芝AT.versicotof)仅等(W.cocos)」2011 小麦'：；^针泡D| (M.gram,n,cola) ] ? 20112012 *— 虫拟站(C jl^iGanoderma 印.）~| ? 201?灵芝(G. Iucidum)~' ‘y ‘2013 ?— K 米小斑^^1p

本文编号：2725868