siRNA对流感病毒血凝素及神经氨酸酶基因的抑制作用及其在病毒重配中应用的研究

发布时间：2020-06-30 22:00

【摘要】：siRNA是广泛存在于生物体内的非编码RNA,其介导的RNAi过程可高效、特异的沉默靶基因,被广泛应用于抗病毒的研究中。已有研究表明,针对流感病毒M,NP等基因的siRNA能够通过抑制基因表达,抑制病毒的增殖。本研究制备了多条针对PR8病毒抗原基因HA和NA的siRNA,测定了其对流感病毒的抑制作用及对基因组的影响。此外,本研究还尝试利用siRNA进行流感病毒疫苗株的重配。在第一部分中,设计了PR8病毒特异地siRNA。通过测序获得疫苗株PR8和野毒株H3N2的序列,根据siRNA设计规则设计了针对PR8病毒HA、NA基因的特异性siRNA。通过序列比对检测并排除与H3N2同源的siRNA序列,最终设计并合成针对PR8的HA和NA基因的特异性siRNA序列共12条。其中包括HA和NA特异的长度为19nt的common siRNA各3条以及长度为25bp的stealth siRNA各3条。在第二部分中,检测了siRNA的抑制效果及特异性。分别在MDCK和MTY6细胞上优化了siRNA抑制实验的转染试剂、浓度及收毒时间等条件。根据优化的条件,通过NA活性、CCID50实验检测了NA特异的siRNA单条、两条及三条联合使用对PR8的抑制效果。结果显示:NA-105与NA-199联合使用的抑制效果最明显,抑制率为86.07%,且不与H3N2发生非特异反应。通过NA活性及血凝实验检测了HA特异的siRNA的抑制效果,显示:HA-56与HA-802联合使用抑制效果明显,抑制率为57.88%,且不与H3N2发生非特异反应。HA与NA特异的siRNA联合使用对PR8的抑制效率,约为95%,高于上述HA或NA siRNA各自联合使用的抑制效果,且对H3N2无抑制作用,特异性好。在第三部分中,用HA和NA特异的siRNA进行PR8与H3N2病毒的重配。采用三种方式制备病毒混合液:(1)在MTY6细胞上分别先后感染PR8和H3N2,细胞病变90%时收获病毒混合液;(2)灭活的PR8与未灭活的H3N2共同感染鸡胚24h后收获病毒混合液;(3)灭活的H3N2与未灭活的PR8共同感染鸡胚24h后收获病毒混合液。共同转染NA-105、NA-199和HA-56、HA-802 siRNA抑制病毒混合液中的PR8病毒增殖,通过噬斑实验筛选单克隆并用RT-qPCR和RT-PCR对病毒进行鉴定。经多轮筛选鉴定并未检测到重配株存在,并对可能的原因进行了分析。在MTY6细胞上用siRNA对PR8病毒连续抑制三代后,通过深度测序检测了siRNA作用下流感病毒基因的突变情况。
【学位授予单位】：中国食品药品检定研究院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：

流感病毒,全球分布,流感,状况

前言冒，简称流感，是由流感病毒（influenza virus）引起的急性传染病围广，易引发局部流行或大流行。据 WHO 报道，流感每年可引起，造成 29 万~65 万例死亡[1]。历史上四次流感大流行给人类造成了年的西班牙流感（H1N1），造成全球约 5 亿人感染，4000 万~5000今引起的死亡病例相当[2, 3]；1957 年的亚洲流感（H2N2）引起了68 年的香港流感（H3N2），造成了全球约 100 万人死亡；1976 年在1N1）造成了约 200 人感染[4, 5]。近几年流感不断爆发，2009 年的0 万人死亡；WHO 统计截止到 2018 年，高致病性禽流感 H5N1 已造死亡；H7N9 自 2013 年出现以来，不断引发死亡病例，严重危害了社

流程图,重配,经典,流程图

图 2 经典重配流程图简介small interfering RNA，siRNA）是双链非编码 RNA 序列，iRNA 介导的基因沉默过程称为 RNA 干扰（RNAinterfe线虫中发现，被广泛应用于多种病毒感染的防治中[22]。学编辑工具，为抗病毒研究开启了新思路。文献报道针go1（Argonaute 1）、Ago3（Argonaute 2）、Ago4（ArgoA 链。针对开放阅读框的 siRNA 在 Ago2 蛋白的核酸内译进行[23, 24]。毒感病毒增殖的原理是将预先设计的外源性 siRNA 分子转

【参考文献】