NIH稀毛小鼠的皮肤转录组分析及其对单增李斯特杆菌的易感性研究

发布时间：2020-07-17 04:17

【摘要】：自发性被毛突变小鼠是研究皮肤毛发和肿瘤等相关疾病的一种理想的动物模型。在2007年,本实验室在封闭群NIH小鼠的繁育过程中发现了一窝被毛生长异常的小鼠,之后通过近交交配手段将这种小鼠保留了下来,实验室将这种小鼠称为NIH稀毛小鼠。在实验的第一个部分,通过对不同日龄的小鼠皮肤切片进行HE染色观察发现小鼠在出生后42d毛发周期循环呈现出异常。为了探明在这一异常表型下的基因表达情况,选择42d的雌性NIH稀毛小鼠背部后侧皮肤进行取样,以正常NIH小鼠为对照,提取RNA后进行转录组测序,测序后阈值设定为差异被数≥2、P0.05共获得5068个差异基因。参照数据库进行Pathway分析和GO分析,结果显示basal cell carcinoma,cell cycle和Hippo,Hedgehog和Wnt signaling pathways等通路在NIH稀毛小鼠中呈现上调趋势,而signal transduction,bacterial and parasitic infection和receptor-mediated pathways呈现下调趋势。通过基因互作分析来筛选与毛囊发育相关的差异基因。为了验证这次测序结果的准确性,从中挑选了12个差异基因,包括8个下调基因和4个上调基因,通过荧光定量PCR来验证。通过这部分的研究,构建了NIH稀毛小鼠出生后42d的背部皮肤差异基因表达谱,差异基因的生物信息学分析结果显示NIH稀毛小鼠在毛发发育和免疫相关的通路上存在改变,运用免疫组化和定量对Pik3r1基因进行了进行了分析,对于其在毛发发育中的具体功能和作用还需要进一步的研究。自发性被毛突变小鼠在毛发表型异常的同时往往伴随着免疫能力的改变。而单核增生性李斯特杆菌(下文统一简称为单增李斯特杆菌)作为一个革兰氏阳性的全身性的胞内致病菌,常被用来评价机体的固有免疫和适应性免疫水平。因此在第二部分实验中,通过腹腔接种单增李斯特杆菌制作感染模型来评价NIH稀毛小鼠的固有免疫能力并分析肠道微生物对感染的影响。结果显示NIH稀毛小鼠死亡率高,体重下降明显,易感器官肝脏和脾脏荷菌数高,脏器损伤严重。肠道内容物的16S测序结果显示梭菌、理研菌、毛螺菌和变形菌的丰度发生改变。这部分的研究结果表明,稀毛小鼠比正常小鼠更容易受到单增李斯特杆菌的感染。感染单增李斯特杆菌可使小鼠的肠道菌群组成发生改变,同时肠道菌群的组成也会影响单增李斯特杆菌对小鼠的感染。这些结果将增进我们对NIH稀毛小鼠的认识,为其作为一种良好的动物模型奠定基础。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R-332
【图文】：

流程图,生物信息学分析,转录组,测序

200μl -20℃预冷的氯仿，上下颠转 15s，室温中 15min，离心管倾斜 45°吸取上清至新离心管中与之等量的-20℃预冷的异丙醇（约 500μl），室温离心 10min。弃掉，加入 1ml75%DEPC 水配制的乙醇溶液洗管内液体，超净台中干燥 5min-10min。（干燥并使 OD260/280 比值偏低）水溶解 RNA，测定溶度后标记分装冻于-80℃冰序及生物信息学分析A 样品部分送样检测质量合格（RIN 值＞6.0）后测序。原始数据按照如下流程进行生物信息学分析。

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第二篇研究内容第一章 NIH 稀毛小鼠皮肤转录组学研究表型小鼠的准确区分。随着时间的推进，稀毛小鼠出现了无毛--表型变化。在 5-6 周龄也就是第二个毛发生长周期的生长期的中鼠呈现出了表型差异的最大化。这一部分我们选择 7 日龄（P7）12）,21 日龄（P21）, 28 日龄（P28）, 33 日龄（P33）, 42 日龄（P行拍照观察，结果如图 1.2 所示。P7 是两种小鼠实现准确区分的表型差异较大的日龄。

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图 1.3 NIH 稀毛小鼠皮肤结构的增龄性改变Fig 1.3 Observe the skin structure of the NIH hairless mice注：NIH 表示 NIH 正常小鼠，HL 表示 NIH 稀毛小鼠2.3 RNA 质量检测及测序数据质控生物学重复设置为 5 个，但是为了防止 RNA 提取失败或是样品运送过程中RNA 的降解，每组准备了 6 个样品，待检测后挑出质量较好的 5 个进行测序。RNA 质量检测结果如图 1.4 所示。A1,B1,C1,D1,E1,F1 为 NIH 正常小鼠的 RNA样品，剩下的 6 个为 NIH 稀毛小鼠的 RNA 样品。12 个样品的 RIN 值均大于 6.0，依顺序选择每组后五个进行后续测序。

【参考文献】