抑制ASIC1a可降低NMDA受体过度兴奋引起的脑缺血再灌损伤

发布时间：2020-07-22 09:59

【摘要】：背景:脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)指脑组织在经历较长时间缺血恢复血流灌注后,出现较再灌注前更严重的组织损伤和神经功能障碍的过程。作为一种继发性损伤,脑缺血再灌注后出现炎症细胞的过度活化,炎症介质的大量释放及细胞凋亡途径的过度激活。但目前对脑缺血再灌注损伤的成因的研究众说纷纭,其中兴奋性氨基酸毒性损伤占据着重要地位。NMDA受体作为一种离子型谷氨酸受体,在兴奋性氨基酸毒性中起重要作用,其对钙离子具有高度的通透性,可调节细胞内作为第二信使的钙离子浓度,影响多条信号通路的激活而介导细胞的死亡,如NMDA受体-CaMKⅡ通路。也可通过与自身连接形成如NMDA受体-DAPK1通路,NMDA受体-PSD95-nNOS通路等。NMDA受体激活还可加重再灌注后炎症反应,继而影响并决定了神经元的死亡或存活,因此有学者认为抑制NMDA受体的活化对脑缺血再灌注后的病情转归有极大的意义。目的:(1)阐明脑缺血再灌注后NMDA受体活化加重脑损伤及炎症反应;(2)探讨在脑缺血再灌注时,ASIC1a的活动对NMDA受体介导脑损伤中炎症反应的影响;(3)研究抑制ASIC1a活化对NMDA受体介导的脑损伤中炎症反应的影响。方法:1.采用线栓法制作小鼠短暂性大脑中动脉栓塞再灌注(tMCAO)模型。通过TTC染色及神经功能缺陷评分的方法,评定小鼠脑组织的损伤程度;ELISA的方法检测炎症因子IL-1 β的表达,蛋白质免疫印迹法(WB)检测p-NF-κB/NF-κB及NMDA受体的NR2A、NR2B亚基的蛋白含量及磷酸化的NR2A、NR2B的表达量。2.运用NMDA受体抑制剂氯胺酮(ketamine 100mg/kg)处理的tMCAO组,评定方法同上。3.WB检测tMCAO模型中ASICla表达量然后在运用ASICla抑制剂阿米洛利(amiloride,l0mg/kg)、氟比洛芬(flurbiprofen,15mg/kg)处理的 tMCAO组,评定方法同上。4.运用膜片钳技术记录海马CA1区的锥体细胞突触后NMDA受体介导的兴奋性电流(EPSCs),观察NMDA受体抑制剂APV,ASICla特异性抑制剂PcTX1,ASICla非特异性抑制剂阿米洛利(amiloride)及新发现具抑制ASICla作用的非甾体类抗炎药氟比洛芬(flurbiprofen)对NMDA EPSCs的作用。5.运用行为学旷场实验、高架十字迷宫及强迫游泳观察连续注射一周治疗剂量ASICla抑制剂氟比洛芬与NMDA受体抑制剂氯胺酮对小鼠精神及行为的影响。结果:1.与假手术组相比,tMCAO可增加脑组织的损伤面积、神经缺陷评分,增加炎症因子TNF-α、IL-1 β、炎症通路中p-NF-κB/NF-κB的表达量,增加NMDA受体的NR2A、NR2B亚基的蛋白含量及磷酸化的NR2A、NR2B的表达量。用NMDA受体抑制剂氯胺酮提前30mmin腹腔注射后可以抑制TNF-α及IL-1β活化、p-NF-κB/NF-κB的表达、脑组织的损伤面积及神经功能缺陷评分。2.与假手术组相比较,tMCAO增加ASICla的表达量。而ASICla抑制剂提前30min腹腔注射后建立tMCAO模型或tMCAO后120min再运用ASICla抑制剂,均可抑制tMCAO后脑组织的损伤面积、神经缺陷评分,氟比洛芬提前30min腹腔注射可减轻炎症因子的产生及炎症通路中p-NF-ΚB/NF-ΚB的表达量。减少NMDA受体的NR2B亚基的表达,而NR2A亚基及磷酸化的NR2A、NR2B的表达量未见明显变化,甚至有所上升。3.膜片钳技术结果显示,NMDA EPSC的幅值可被PcTXl显著减少,从灌流液中去除PcTXl后EPSCs恢复到原来大小。阿米洛利和氟比洛芬也有同样的效果。4.NMDA受体抑制剂氯胺酮可造成小鼠焦虑与抑郁样行为,而氟比洛芬钠并无明显影响。结论:脑缺血再灌注时,NMDA受体参与介导了脑损伤及炎症反应同时,ASICla可能通过增加NMDA受体活化及表达,参与了脑缺血再灌注损伤及炎症反应;ASICla抑制剂较NMDA受体抑制剂有更轻的精神副作用。
【学位授予单位】：滨州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743;R-332
【图文】：

不仅ＮＭＤＡ受体的ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ蛋白含量表达上调，磷酸化的ＮＲ２Ａ（ｐ－逡逑ＮＲ２Ａ）及ＮＲ２Ｂ邋（ｐ－ＮＲ２Ｂ）蛋白含量表达也有增加。并且它们的表达在大脑中动逡逑脉栓塞再灌注２４ｈ还处于一个相对较高水平（图１Ａ）。ｔＭＣＡＯ组（ｔＭＣＡＯ模拟脑逡逑缺血再灌注组）与ｓｈａｒａ组（假手术组）相比具有明显的趋势。逡逑接着我们进一步检测ｔＭＣＡＯ模型中炎症介质ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－１０的表达，炎逡逑症通路中ｐ－ＮＦ－邋ｋ邋Ｂ／ＮＦ－邋ｋ邋Ｂ的表达量评价炎症反应的程度，并用神经功能缺陷逡逑评分及ＴＴＣ染色方法评价脑损伤的程度。结果显示模型中炎症介质ＴＮＦ－ａ及逡逑ＩＬ－１Ｐ、ｐ－ＮＦ－ｋＢ／ＮＦ－ｋＢ的表达（图１Ｂ）、神经功能缺陷评分均增加，ＴＴＣ染逡逑色并计算脑梗死的面积也增加（图１Ｃ）邋，邋ＨＥ染色死亡细胞增加（图ＩＤ）。ｔＭＣＡＯ逡逑组与ｓｈａｍ组相比，差异明显。逡逑然后我们在ｔＭＣＡＯ模型建立前３０分钟提前运用氯胺酮处理，于２４小时后逡逑提取细胞膜蛋白及突触后膜蛋白，ＷＢ检测其中ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ及磷酸化的ＮＲ２Ａ邋（ｐ－逡逑ＮＲ２Ａ）、ＮＲ２Ｂ邋（ｐ－ＮＲ２Ｂ）蛋白含量。结果显示：ＮＭＤＡ受体抑制剂氯胺酮预处理后

蛋白印迹技术（ＷＢ）结果显示，短暂性大脑中动脉栓塞模拟脑缺血再灌注逡逑的模型中，ＡＳＩＣｌａ蛋白含量表达上调，并且它们的表达在大脑中动脉栓塞再灌逡逑注２４ｈ还处于一个相对较高水平（图２Ａ）。ｔＭＣＡＯ组（ｔＭＣＡＯ模拟脑缺血再灌注逡逑组与邋ｓｈａｍ组假手术组相比差异具有统计学意义ｐ＜０．邋０５）。然后在ｔＭＣＡＯ逡逑模型建立前３０分钟预防性或（和）ｔＭＣＡＯ模型建立后２小时治疗性运用ＡＳＩＣｌａ逡逑抑制剂处理，２４小时后通过ＴＴＣ染色及神经功能缺陷评分的方法，评定小鼠脑逡逑组织的损伤程度；ＥＬＩＳＡ的方法检测炎症因子ＩＬ－１０的表达，ＷＢ检测检测口－逡逑ＮＦ－邋ｋ邋Ｂ／ＮＦ－邋ｋ邋Ｂ的表达量评定炎症反应程度，结果显示：逦运用两种不同的逡逑ＡＳＩＣｌａ抑制剂进行预防性或治疗性处理，即将实验组分为四小组：逡逑１？阿米洛利预防性用药（ａｍｉｌｏｒｉｄｅ邋ｐｒｅ＿３０ｍｉｎ）；逡逑２－阿米洛利治疗性性用药（ａｍｉｌｏｒｉｄｅ邋ｐｏｓｔ－３０ｍｉｎ）；逡逑３．

图３邋ＡＳＩＣｌａ通过调节ＮＭＤＡ受体参与脑缺血再灌注损伤Ａ．与短暂性大脑中动脉栓塞逡逑（ｔＭＣＡＯ）模拟脑缺血再灌注组相比，ＡＳＩＣｌａ抑制剂氟比洛芬（ｆｌｕｒｂｉｐｒｏｆｅｎ）降低了邋ＮＭＤＡ逡逑受体的ＮＲ２Ｂ亚基的蛋白的表达量。但ＮＲ２Ａ亚基及磷酸化的ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ的表达量与模型逡逑，。．

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本文编号：2765664