布鲁氏菌外膜囊泡（OMVs）的制备及免疫原性评价

发布时间：2020-08-11 14:43

【摘要】：布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人畜共患病,可造成家畜的流产甚至人类波状热、关节炎、脑膜炎等。目前动物布鲁氏菌疫苗主要为弱毒疫苗,但这类疫苗存在毒力较强容易导致流产且保护力较低的缺点。鉴于脑膜炎奈瑟菌外膜囊泡(OMVs)疫苗的成功研制,本项目对布鲁氏菌OMVs的制备方法进行探索,并在小鼠模型上对OMVs及其组分的免疫原性和免疫保护性进行评价,为布鲁氏菌新型亚单位疫苗的研究奠定了基础。目的:(1)以羊种布鲁氏菌新疆流行株043为研究对象,对提取的OMVs的形态和组分进行鉴定,探究其对巨噬细胞细胞因子表达和粘附内化的影响。(2)建立与OMVs相关的外膜总蛋白(OMP)、重组外膜蛋白和脂多糖核心蛋白血清学评价方法,筛选获得具有较强特异性和反应原性的蛋白。(3)分析布鲁氏菌外膜囊泡及其相关蛋白的免疫原性及免疫保护作用。方法:(1)通过超高速离心提取OMVs,使用透射电镜观察其形态和大小,利用SDS-PAGE鉴定OMVs的蛋白组成,通过RT-PCR检测OMVs刺激小鼠巨噬细胞后细胞因子的表达,并通过CFU计数评价其对细胞粘附内化的影响。(2)对OMP进行提取并表达和纯化BP26、OMP10、GMD、ManB蛋白,通过Western Blot验证其反应原性,通过间接ELISA筛选特异性和反应原性高的优势蛋白。(3)分别使用弗氏佐剂和纳米佐剂(LDH)乳化OMVs、OMP、BP26、OMP10及BP26+OMP10双抗原免疫小鼠,通过间接ELISA检测其特异性抗体水平,通过流式细胞术检测T淋巴细胞亚型以及通过ELISA检测IFN-γ和IL-4的表达水平评价其细胞免疫水平。小鼠加强免疫14天后使用布鲁氏菌M5株以2×10~6CFU进行攻毒实验,攻毒15天后进行组织病理学观察和脾脏载菌量的检测,评价其免疫保护力。结果:(1)布鲁氏菌043 OMVs大小在20-200nm之间,平均60.5nm,其蛋白组成主要为22、29、51KD左右;OMVs可显著性诱导小鼠巨噬细胞产生的IFN-γ、IL-6、IL-12、TNF-α和IL-10基因的转录表达,且IFN-γ、IL-6表现为早期表达。且OMVs可显著增强细胞对布鲁氏菌的粘附和内化作用。(2)成功获得了布鲁氏菌OMP和BP26、OMP10、GMD、ManB蛋白,通过方阵滴定法建立了不同抗原的最佳ELISA反应条件,并筛选得到了反应原性较好的布鲁氏菌OMVs、OMP、BP26、OMP10。(3)免疫实验结果显示:实验动物可产生特异性抗体,且在初次21天时达到最高水平,复免后抗体明显升高。弗氏佐剂和纳米佐剂免疫组的脾脏淋巴细胞中均可检测到高水平的IFN-γ,但IL-4的水平与PBS组无显著差异,表明OMVs和及其相关蛋白均可诱导较强的Th1型免疫应答。淋巴细胞亚群检测结果显示:各组抗原均能诱导非特异性T淋巴细胞增殖作用,而相对于OMP、BP26和OMP10,在纳米佐剂作用下,OMVs很好的诱导了细胞免疫,促进了CD4+T细胞表达,诱导更强的Th1型免疫反应应答。布鲁氏菌感染免疫后小鼠均能引起脾、肝、肺和肾不同程度的病理变化,纳米佐剂组中OMVs和BP26有轻微病理变化,其他试验组病变较明显且严重。费氏佐剂组中OMP10和OMVs病变较轻。攻毒实验结果显示:纳米佐剂组中OMVs脾指数最低,与未免疫组相比差异极显著(p0.01),同时脾脏载菌量与未免疫组差异极显著(p0.01);弗氏佐剂组中OMP10脾指数和CFU计数最低,较未免疫差异极显著(p0.01)。结论:(1)成功建立了羊种布鲁氏菌OMVs的提取方法,并鉴定了其形态和大小。(2)羊种布鲁氏菌OMVs可诱导RAW264.7细胞产生强烈的Th1型免疫应答,并促进RAW264.7细胞对细菌的粘附和内化。(3)建立并优化了血清学评价的间接ELISA方法,并筛选了具有特异性且反应原性较好的免疫优势抗原。(4)小鼠免疫接种和攻毒试验证实了OMVs的免疫原性和保护作用,以及纳米佐剂对OMVs具有较高的免疫增强作用。
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：

模式图,模式图,外膜

性菌和古细菌也会产生 OMVs。关于外膜囊泡大量的研究发现其表现能。有趣的是，OMVs 作为一种潜在的疫苗抗原和佐剂可以用于预防的感染。Vs 产生及类型Vs 的产生在在培养基中生长的细菌可产生 OMVs，而且在体外感染的细胞内或物的组织的生物膜上也已经观察到 OMVs 的产生。OMVs 是革兰氏阴泌的产物，是细菌外膜以出芽的方式释放并在表面形成的一种囊泡为球形，直径大约在 20 250 nm 之间[57]。有研究称一些革兰氏阳性类似的囊泡[58,59]。后续研究发现，几乎所有革兰氏阴性菌都可以产生构组成成分除外膜蛋白外还包含其他的膜结构成分，所以将这种膜结囊泡(图 1)。Kuehn 等的大量研究发现，OMVs 生物发生是一个复杂各种原因产生了 OMVs，包括包膜应激松弛，群体感应，防御，长距素反应等[60,61]。

布鲁氏菌,外膜,细菌碎片,负染电镜

布鲁氏菌外膜囊泡(OMVs)的制备及免疫原性评价2. 实验结果2.1 两种方法提取的布鲁氏菌 043 的 OMVs 形态比较负染电镜显示两种方法提取的 043 的 OMVs 在形态方面没有差异。均为 20～200nm 间的球形囊泡结构，视野下未发现细菌碎片，证实了 OMVs 的纯度较高（1-1）。AB

布鲁氏菌,大小分布,外膜

B 1-1 两种方法提取的布鲁氏菌 043 的外膜囊泡形态比较SB 液体培养基提取 OMVs；B:方法二 TSA 固体培养基提取 Oigure 1-1 the morphology of OMVs extracted by two methods OMVs extraction by TSB solid medium;B:The second method of Oby TSAliquid media.下对外膜囊泡直径进行度量，发现外膜囊泡直径在 20-16差 30nm），主要集中在 58nm 左右，如图 1-2。

【参考文献】