结核分枝杆菌PPE25、PPE27和PE19蛋白对巨噬细胞RAW264.7的影响及表达ppe25基因的重组耻垢分枝杆菌的
发布时间：2020-08-12 00:03
【摘要】：结核病(Tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)感染引起的慢性呼吸道传染病,世界上三分之一的人口已被感染,每年新发病例接近九百万例,它在世界范围内传播、发病是其盛行的原因之一。pe/ppe基因占据结核分枝杆菌基因组编码区的10%,PE/PPE蛋白家族中一些成员被鉴定为是毒力因子,参与宿主免疫反应,但大部分PE/PPE蛋白的确切功能还需要探索,其中包括PPE25、PPE27和PE19蛋白。本研究利用原核体系表达和纯化获得的PPE25、PPE27、PE19蛋白与小鼠巨噬细胞RAW264.7相互作用以初步解析其生物功能。此外,为以后更深入地研究该家族蛋白的功能和在机体免疫调节中的作用,成功构建了带有FLAG标签的重组穿梭表达载体pMV261-ppe25,并电转化至无毒快速生长的耻垢分枝杆菌,从而获得重组菌株。1.结核分枝杆菌PPE25、PPE27和PE19蛋白对巨噬细胞RAW264.7细胞因子和死亡方式的影响纯化获得重组蛋白PPE25.PPE27和PE19,去除内毒素后经过鲎试剂测定内毒素含量,BCA法测定蛋白浓度。按照浓度0、1.25、2.5、5.0和10.0μg/mL分别刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7,作用24 h后,用Cell Proliferation ELISA BrdU (Colorimetric)试剂盒检测细胞活性,发现PPE25、PPE27和PE19对RAW264.7的活性有显著的抑制作用(p0.05),且呈现剂量依赖性。重组蛋白以不同浓度作用于巨噬细胞RAW264.7,作用24和48 h采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒检测细胞死亡方式。结果显示,PPE25、PPE27和PE19都导致RAW264.7发生细胞坏死,说明PPE25、PPE27和PE19蛋白都具有毒性。同时,应用液体悬浮芯片系统luminex200方法检测不同浓度的重组蛋白PPE25、PPE27和PE19与RAW264.7相互作用后培养上清中细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12p40的表达量的变化,从而评价PPE25、PPE27和PE19对RAW264.7炎性反应的影响。重组蛋白PPE25、PPE27和PE19分别以1.25、2.5、5.0和10.0 μg/mL的浓度刺激RAW264.7,作用24和48h后,与空白组相比,重组蛋白PPE25引起IL-6分泌量显著上调(p0.05),TNF-α分泌量有所上升。重组蛋白PE19引起IL-6分泌量显著上调(p0.05),TNF-α分泌量没有明显差异。然而重组蛋白PPE27引起IL-6分泌量显著下调(p0.05),TNF-α分泌量也下调。此外,重组蛋白PPE25、PPE27和PE19促使巨噬细胞IL-1β表达量均低于检测线2.13 pg/mL,IL-12p40表达量均低于检测线2.09 pg/mL。这些差异表达证实重组蛋白PPE25、PPE27和PE19可以通过调控促炎性因子IL-6的表达引起巨噬细胞免疫应答。2.表达结核分枝杆菌ppe25基因的重组耻垢分枝杆菌的构建以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,采用PCR技术扩增ppe25基因序列并添加FLAG标签,以便Western-blot检测其表达。将PCR产物定向克隆到克隆载体pCR2.1,测序结果与GenBank公布的基因序列完全一致。经BamH I/EcoR I双酶切获得ppe25酶切片段,克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261,通过酶切及PCR鉴定正确后,将重组质粒pMV261-ppe25电转化耻垢分枝杆菌mc2155感受态,构建、筛选重组耻垢分枝杆菌,命名为rMS-pMV261-ppe25。重组耻垢分枝杆菌的PCR和酶切鉴定表明构建正确。重组菌经45℃30min诱导表达,超声裂解后的Western-blot结果表明,目的蛋白与抗PPE25兔多抗血清和抗FLAG标签单克隆抗体发生特异性的反应,与预期条带大小39.51kD一致。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378.911
【图文】：
ＰＡＭＰｓ，其中包括脂甘聚糖（ＬＭ）、脂阿拉伯糖甘聚糖（ＬＡＭ）、脂蛋白Ｌｐ巧、ＬｐｒＧ、逡逑ＬｐｒＡ、ＭＰＴ８３、１１８９６０和￡８冷１＇－妒２－１７１。研究表明很多了８相关的蛋白倾向于与化１１２相互逡逑作用。如图２所示，ＴＬＲ２不仅能独自发挥作用，也可Ｗ与其他表面受体包括共同受体和逡逑辅助受体结合X椙颗涮宓氖侗鸷痛荨；缬耄裕蹋遥被颍裕蹋遥缎饔谩⒏ㄖ芴澹茫模保村义现铝τ冢蹋穑瘢取ⅲ蹋穑颍呛停蹋穑颍潦侗稹⒍ㄖ芴澹茫模常吨铝τ诩觳猓蹋穑颍粒蕖＠醋圆煌岷隋义细塑缫鹬值模蹋投寄芤鹁奁叵赴せ睢＃颍停校裕福衬芤穑裕危疲帷⒈龋逗驼保玻穑矗板迳义喜⑶夷苌系鳎桑疲危盏嫉模停龋茫畋泶铮虼薠椙苛隋澹颍停校裕福扯喾粝颍茫模矗韵赴某实荨ｅ义希颍停校裕福场ⅲ桑疲危倩蛘撸颍停校裕福秤耄桑疲危峰濉鸸婕ぞ捺拖赴蠖寄苌系鳎危戏置谒健Ｗ艿腻义侠此担颍停校裕福匙魑裕蹋遥布せ罴聊艿鹘谙赴蜃拥姆置诤吞岣呔轛S细胞的功能。除此Ｗ外，逡逑ＴＬＲ２调节的信号通路能引起很大范围宿主免疫反应用于清除ＭＴＢ，总结如图ｌｔｉ８ｌｓＥＳＡＴ－６逡逑通过ＴＬＲ２依赖途径瓦解宿主免疫反应，ＭＴＢ的ＥＳＡＴ６与ＴＬＲ２胞外直接相互作用挪制逡逑巨睡细胞的ＴＬＲ信号通路。很多ＭＴＢ的ＰＥ／ＰＰＥ蛋白能与ＴＬＲ２直接相互作用，但是不逡逑同的ＰＥ／ＰＰＥ蛋白激发不同的ＴＬＲ２下游信号级联放大。ＰＰＥ３４ｔＷ激发ＴＬＲ２－Ｐ３８邋ＭＡＩ＞Ｋ信逡逑号通路并产生正－１０
Ｃｙｔｏｋｉｎｅ邋／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ邋Ｓｔａｎｄａｒｄ邋掠准品粉末溶于邋２５０邋ｎＬ邋ＳＷ邋后浓度是邋１００００邋ｐｇ／ｍＬ，按照梯逡逑度稀释后，依次稀释成２０００、４００、８０、１６、３．２邋ｐｇ／ｍＬ，系统检测自动生成际准曲线。如逡逑图１－５所示，各细胞因子的相关系数Ｒ２在０．９７￣１．００之间，从而保证检测样品的准确性。逡逑ＩＬ－６逡逑W'－ＩＰ逡逑拉，４２８％，Ｒ？，０燃逦＊０．９３４逡逑巧３－逦／逦巧４－逡逑．－Ｉ逦Ｌ逦逦Ｌ逦．逡逑巧－，逦如逦如逦巧Ｓ逦巧１日１逦１0３逦巧５逡逑柳，＇逦ｐｇ／ｍｌ逡逑W'－１２ｐ４０逦ＴＮＦ－ａ逡逑议＊３欲，巧？０．~s逦ＣＶ，１７i辏螅ⅲ希忧慑义希保板澹吻桑渭滓诲义锨芍粒吻桑玻义希∪铡＃
本文编号：2789747
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378.911
【图文】：
ＰＡＭＰｓ，其中包括脂甘聚糖（ＬＭ）、脂阿拉伯糖甘聚糖（ＬＡＭ）、脂蛋白Ｌｐ巧、ＬｐｒＧ、逡逑ＬｐｒＡ、ＭＰＴ８３、１１８９６０和￡８冷１＇－妒２－１７１。研究表明很多了８相关的蛋白倾向于与化１１２相互逡逑作用。如图２所示，ＴＬＲ２不仅能独自发挥作用，也可Ｗ与其他表面受体包括共同受体和逡逑辅助受体结合X椙颗涮宓氖侗鸷痛荨；缬耄裕蹋遥被颍裕蹋遥缎饔谩⒏ㄖ芴澹茫模保村义现铝τ冢蹋穑瘢取ⅲ蹋穑颍呛停蹋穑颍潦侗稹⒍ㄖ芴澹茫模常吨铝τ诩觳猓蹋穑颍粒蕖＠醋圆煌岷隋义细塑缫鹬值模蹋投寄芤鹁奁叵赴せ睢＃颍停校裕福衬芤穑裕危疲帷⒈龋逗驼保玻穑矗板迳义喜⑶夷苌系鳎桑疲危盏嫉模停龋茫畋泶铮虼薠椙苛隋澹颍停校裕福扯喾粝颍茫模矗韵赴某实荨ｅ义希颍停校裕福场ⅲ桑疲危倩蛘撸颍停校裕福秤耄桑疲危峰濉鸸婕ぞ捺拖赴蠖寄苌系鳎危戏置谒健Ｗ艿腻义侠此担颍停校裕福匙魑裕蹋遥布せ罴聊艿鹘谙赴蜃拥姆置诤吞岣呔轛S细胞的功能。除此Ｗ外，逡逑ＴＬＲ２调节的信号通路能引起很大范围宿主免疫反应用于清除ＭＴＢ，总结如图ｌｔｉ８ｌｓＥＳＡＴ－６逡逑通过ＴＬＲ２依赖途径瓦解宿主免疫反应，ＭＴＢ的ＥＳＡＴ６与ＴＬＲ２胞外直接相互作用挪制逡逑巨睡细胞的ＴＬＲ信号通路。很多ＭＴＢ的ＰＥ／ＰＰＥ蛋白能与ＴＬＲ２直接相互作用，但是不逡逑同的ＰＥ／ＰＰＥ蛋白激发不同的ＴＬＲ２下游信号级联放大。ＰＰＥ３４ｔＷ激发ＴＬＲ２－Ｐ３８邋ＭＡＩ＞Ｋ信逡逑号通路并产生正－１０
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本文编号：2789747
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