Cereblon通过促进c-Jun泛素化降解抑制LPS诱导的炎症反应和细胞凋亡

发布时间：2020-08-13 08:11

【摘要】：研究背景和目的Cereblon(CRBN)是cullin-4 RING E3泛素连接酶(CRL4)复合体的底物受体,促进底物蛋白与泛素分子的连接而实现泛素化,进而通过泛素-蛋白酶体系统行降解底物。原癌基因蛋白c-Jun是活化蛋白Activated protein-1(AP-1)转录因子复合体的重要组成成分之一,AP-1活性的提高可以促进炎症反应。一种调控AP-1活性的机制是调控AP-1复合体各组成成分的表达以及活性,尤其是原癌蛋白c-Jun。在我们的前期工作中,我们通过质谱数据分析发现CRBN过表达能够下调c-Jun的蛋白水平。随后的工作中我们进一步证实了CRBN通过促进c-Jun泛素化而对其降解。c-Jun/AP-1位于炎症反应信号通路的下游,因此我们猜想CRBN是否能够通过调控c-Jun/AP-1活性而参与到炎症反应的调控中来。尽管目前有文献报道显示CRBN能够调控炎症反应,但是这一作用与CRBN组成的E3泛素连接酶的酶活功能无关。那么CRBN参与的炎症反应是否与CRBN及相关的E3泛素连接酶活性相关呢?在本课题中我们将通过一系列实验验证CRBN及相关的E3泛素连接酶是否也参与了炎症反应的调控,其对炎症反应的调控是否影响细胞凋亡。研究方法构建GFP、CRBN的稳转HEK293T细胞株。利用细胞培养稳定同位素标记技术(SILAC)以及质谱分析法对蛋白进行定性定量分析,通过蛋白数据库搜索获得过表达GFP组与CRBN组的细胞中蛋白水平明显发生变化的蛋白,发现CRBN明显下调c-Jun蛋白水平。随后我们用生化实验验证质谱分析的结果,通过免疫印迹法进一步在HEK293T细胞以及CRBN敲除小鼠大脑组织中证实CRBN对c-Jun蛋白表达水平的调控。接着我们用免疫共沉淀、免疫荧光共定位及免疫印迹法检测c-Jun与CRBN是否存在相互作用。同时用生物化学方法探究CRBN调控c-Jun蛋白泛素化、稳定性的分子机制。在炎症细胞中用双荧光素酶报告基因检测系统、q-PCR实验和蛋白免疫印迹法检测CRBN对c-Jun/AP-1活性以及炎性相关介质如IL-1β、IL-6、i NOS和COX-2等m RNA或蛋白水平的影响,此外我们在LPS诱导的THP-1巨噬细胞中用流式细胞仪实验检测CRBN对细胞凋亡的影响,并探索这一调控是否与c-Jun/AP-1有关。研究结果对前期的质谱数据进行分析,我们发现CRBN能够下调c-Jun蛋白表达水平。通过生物化学实验我们证实了CRBN对c-Jun的调控关系。HEK293T细胞中过表达CRBN能够明显下调c-Jun蛋白水平,在加入蛋白酶体抑制剂MG132处理后发现CRBN诱导的c-Jun蛋白下降得到明显回升。沉默CRBN的HEK293T细胞或CRBN敲除的小鼠大脑组织中c-Jun蛋白水平明显上升。蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)处理后CRBN过表达组中c-Jun蛋白的半衰期明显缩短。同时q-PCR实验发现CRBN并不影响c-Jun的m RNA水平。蛋白质泛素化检测实验发现,与阴性组相比,CRBN过表达后明显增强c-Jun的泛素化水平,且主要形成K48位多聚泛素链。在炎症细胞模型中,双荧光素酶报告基因实验发现,与对照组进行对比,CRBN过表达能够明显下调AP-1的转录活性。通过q-PCR实验进一步发现,CRBN能够下调脂多糖(LPS)诱导的炎症反应,当细胞用NF-κB抑制剂BAY11-7082处理以及c-Jun敲低后,CRBN的过表达及敲低对炎症反应的调控完全受阻。流式细胞实验发现CRBN能抑制LPS诱导的细胞凋亡。研究结论质谱数据分析发现CRBN能够调控c-Jun蛋白表达。生化实验证实CRBN与c-Jun存在相互作用,并且CRBN能够通过上调c-Jun的泛素化水平而促进c-Jun通过泛素-蛋白酶体系统降解,使c-Jun的稳定性降低进而使转录因子AP-1复合体活性降低,最后产生抑制炎症反应和对抗细胞凋亡的作用。本文证实了CRBN对炎症反应以及细胞凋亡的调控,并阐明了其调控的分子机制。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R364.5
【图文】：

蛋白质组学,蛋白

定量蛋白质组学鉴定c-Jun为Cereblon(CRBN)的下调蛋白

免疫印迹法,过表达,生物学,蛋白

质谱数据表明 CRBN 能够下调 c-Jun 的蛋白表达水平，接下来我们通过生化实验进一步验证 CRBN 对 c-Jun 蛋白表达水平的调控。为此，我们在 HEK293T 细胞中过表达pcDNA3.1或HA-CRBN质粒（图3.2A），或梯度过表达HA-CRBN质粒（图3.2B），转染 48 小时后收集细胞并裂解细胞得全细胞裂解液，所得的蛋白样品进行免疫印迹法检测。实验结果显示 CRBN 能够明显下调 c-Jun 蛋白的表达水平，同时 CRBN 对c-Jun 蛋白表达的调控具有剂量依赖性。为了进一步探究 CRBN 对 c-Jun 蛋白水平的影响，我们在 HEK293T 细胞中用两种不同序列的 siRNA 沉默 CRBN 并检测 c-Jun 蛋白表达水平的变化。在转染不同序列的 siCRBN 48 h 后收集细胞并将获得的蛋白样品进行免疫印迹法分析。结果显示两条不同的 siCRBN 均能够有效地沉默 CRBN 基因的表达并使得 c-Jun 蛋白表达水平明显回升（图 3.2D）。三次生物学重复统计显示siCRBN#1 的敲低效率更高，因此后面人源细胞的实验中均用这条 siCRBN 进行敲低实验。此外我们将获得的 CRBN 敲除小鼠及野生型小鼠脑组织蛋白样品进行 Westernblotting 验证，发现当 CRBN 敲除后 c-Jun 蛋白表达水平明显升高（图 3.2 C）。四组实验均进行三次生物学重复

相互作用

图 3.3 c-Jun 与 CRBN 相互作用并共定位。 c-Jun interacts and colocalizes with Ctates CRBN and (B) CRBN pulls down c-Jun in stells were treated with LPS (200 ng/mL) for 12 h ah IgG or c-Jun (or CRBN) antibody overnight. Pded to the cell lysate for purification. Cell lysates ed for c-Jun, CRBN, and/or GAPDH. Note: LPS wenous c-Jun protein level in RAW264.7 cells. (C) s were performed in HEK293T cells. HEK293T cenoblotted as described in (A and B) without LPS sRBN. HEK293 cells were transiently transfected wising lipofectamine3000 transfection reagent forith FLAG (c-Jun) and GFP antibodies for chst was used to stain the nuclei. Scale bar: 20 m.

【相似文献】