伯氏疟原虫受精前后抗原Pbg37的鉴定及其传播阻断效应与功能的研究

发布时间：2020-08-14 23:32

【摘要】：目的:疟疾是由疟原虫引起的通过雌性按蚊传播的感染性寄生虫疾病,它严重威胁人类健康并给发展中国家带来严重的社会和经济负担,已成为全球最严重的公共卫生问题之一。过去的十年中,在疟疾的控制上有了重大进展,然而对于一些疟疾的高密度流行国家来说为实现彻底消除疟疾这一目标,仍面临许多技术难题。目前疟疾控制措施在很大程度上依赖于有效的化疗治疗受感染的病人和病媒控制如经杀虫剂处理的蚊帐和室内药物的喷洒。然而,由于耐药疟原虫和耐杀虫剂蚊子的出现,进一步增加了疟疾的有效防控的难度。国际疟疾消除专家委员会(MalERA)认为疫苗可以有效地阻断疟疾的传播对于疟疾的消除非常重要。目前疟疾疫苗的研发主要针对有性发展阶段的传播阻断疫苗(transmission-blocking vaccines,TBVs)。TBVs旨在诱导宿主免疫反应干扰疟原虫从人体传播到蚊子,进一步阻止疾病在人类之间传播。TBVs候选抗原主要表达在蚊阶段疟原虫表面,不受脊椎动物免疫系统选择压力的影响,显示出较低的多态水平,不会出现抗原变异,更有利于疫苗的免疫效果,因此,被认为是加速疟疾控制和支持最终根除疟疾的新策略。尽管如此,但TBVs的研发进展依然迟缓,迄今为止只有Pfs25和Pvs25的传播阻断疫苗已经达到临床试验的第一阶段,迫切需要筛选并增加新型疟原虫有性阶段候选抗原,明确其分子结构、表达阶段、生物学功能及其免疫学特性,以便开发高效、安全的TBV疫苗。在TBV新型抗原的发现和基因功能的研究中,我们发现了一个在疟原虫有性阶段高度保守的基因。PBANKA_060330在啮齿类动物寄生虫P.berghei被指定为Pbg37,它同时表达在受精前期和受精后期两个阶段。敲除这个基因主要影响了雄性配子的形成和功能。抗重组蛋白Pbg37(rPbg37)的血清在直接蚊子喂养实验中产生了明显的阻断传播活力。研究方法:1)实验动物、疟原虫及蚊子。6-8周龄BALB/c小鼠购买于北京动物研究所。鼠疟P.berghei ANKA株通过小鼠的传代培养保存。小鼠感染由腹腔内注射1×10~7个P.berghei感染的红细胞(RBCs)。斯氏按蚊(Hor株)饲养在25°C恒温、50-80%湿度的蚊虫室里。所有动物实验均经过中国医科大学动物伦理委员会批准。2)重组蛋白的表达和纯化。为表达重组Pbg37蛋白(rPbg37),我们去掉信号肽和跨膜区,选取蛋白区域(26-88aa)设计引物。提取总RNA反转录成cDNA。利用引物pbg37-F和pbg37-R扩增Pbg37片段。PCR产物及pET32a(+)载体经过Not I和Bam HI消化后,将片段克隆到载体上。经过双酶切和测序鉴定正确后,将重组载体转入大肠杆菌Rosetta-gami B细胞(DE3)。经1mM IPTG(isopropyl-D-1-thiogalactoside)于19°C诱导8 h,使用镍氨三乙酸琼脂糖柱Ni-NTA His·Bind Superflow(Novagen)进行蛋白纯化。pET32a空载体表达和纯化的蛋白作为免疫动物的阴性对照。纯化的重组蛋白在4°C的磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)中透析过夜,并用10%SDS-PAGE凝胶电泳进行结果检测。3)实验动物免疫。6-8周龄BALB/c雌性小鼠5只(n=5),通过皮下注射重组蛋白rPbg37(50μg/鼠)与完全弗氏佐剂乳化产物。每隔两周加强免疫一次rPbg37(25μg/鼠),共强化免疫两次。另一组老鼠(n=5)应用相同的免疫程序免疫阴性对照蛋白。于每次免疫的前一天与最后一次免疫后第14天,尾静脉收集每只小鼠血液(100μl/只),室温凝集后收集血清。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测rPbg37免疫血清的抗体滴度。酶标仪检测490 nm处OD值。免疫血清抗体滴度终点的定义是光密度(OD)值在490 nm时实验组的平均值不大于对照组均值+3×标准差的抗血清的稀释倍数。4)免疫印迹和间接免疫荧光试验(IFA)。为了确定Pbg37蛋白的表达阶段,使用Nycodenz梯度分别纯化P.berghei的裂殖体、配子体、合子和动合子,用含有蛋白酶抑制剂的2%SDS提取蛋白。等量的疟原虫蛋白质(10μg)用10%SDS-PAGE凝胶分离,并转移到PVDF膜(Bio-Rad)。用抗rPbg37鼠血清(1:200)标记PVDF膜,用ECL发光方法在荧光图像分析系统中检测。纯化的疟原虫用抗rPbg37鼠血清(以3%BSA/PBS稀释至1:200)标记。用10μl DAPI染核10分钟后经抗淬灭封片剂ProLong?Gold antifade reagent封片,在奥林巴斯BX53荧光显微镜下观察结果。Pbs21单克隆抗体染动合子用作阳性对照。对照蛋白免疫血清作为阴性对照。5)基因敲除。基因敲除采用双交叉同源重组方法得到pbg37基因敲除株(Δpbg37)。pbg37 5′和3′同源臂分别使用5UTR-F×5UTR-R和3UTR-F×3UTR-R扩增,克隆至含有人dhfr耐药基因的载体PL0034中。10μg质粒用Hind III和Xho I线性化后使用Nucleofactor?电转仪转染至纯化的P.berghei裂殖体。转染后的疟原虫和50μl完全培养基尾静脉打给小鼠。二十四小时后,小鼠的饮用水中加入乙胺嘧啶(70μg/毫升)筛选转染成功的疟原虫。筛选后的疟原虫通过PCR方法进行鉴定。当小鼠的感染率达到3%时,尾静脉取血100μl提取基因组DNA,通过引物P1×P2、P1×P3及P4×P5进行内源性PCR确认pbg37基因敲除。6)Δpbg37型疟原虫的表型分析。为了研究pbg37基因敲除后对疟原虫生长的影响,6-8周龄的雌性BALB/c小鼠,每组5只,腹腔注射1×10~6Δpbg37感染的红细胞(克隆KO1和KO2),或相同数量的野生型P.berghei感染的红细胞。感染后第3天开始每天制备血涂片,经吉姆萨染色后显微镜下观察疟原虫形态、疟疾血症、配子体率及配子体比率。配子体比率是100个配子体中分化成雌雄配子体的性别比例。成熟的配子体率是在100个配子体中成熟的配子体所占的比例。计数雄性配子体的出丝和动合子的形成使用体外培养的方法。取含有相同数量的成熟雄性配子体的感染血液与动合子培养基混合,25°C下孵育15分钟产生配子,出丝视野的计数在100X光学显微镜下进行,每只鼠计数二十个视野。为了观察动合子形成,上述孵育的血液继续在19°C下孵育24 h,单克隆抗体Pbs21用来标记动合子,荧光显微镜下计数。疟原虫感染蚊子的能力通过直接蚊子饲养试验来评估。小鼠感染后的第三天疟疾血症达到5-7%,经饥饿12 h的成熟雌性按蚊吸食血液1 h。去除未吸血的按蚊,吸血后的蚊子饲养12天后取30只蚊子解剖,取出蚊中肠用0.5%汞溴红药水染色10分钟,计数蚊子感染率(受感染的蚊子的数量/总数量的蚊子)和阳性蚊中肠的卵囊数。7)传播阻断能力的评估。Pbg37的传播阻断能力的评估分别使用体外动合子形成试验和直接蚊子饲养试验。体外动合子形成试验将小鼠腹腔内注射1×10~6个P.berghei感染的红细胞。在感染后的第3天,将动合子培养基稀释的1:5、1:10和1:50的抗rPbg37鼠血清或阴性对照血清与10μl感染小鼠的血液混合,总体积达到50μl。25°C下孵育15分钟计数雄性配子体出丝视野,继续19°C下孵育24 h计数动合子形成数量。蚊子喂养实验将小鼠免疫rPbg37或阴性对照蛋白,在第3次免疫后的第14天,给免疫的小鼠腹腔注射感染1×10~6个P.berghei疟原虫。感染后第3天,每只小鼠喂养至少50只饥饿24h的成熟斯式按蚊,吸血后10天计数蚊子感染率和卵囊密度。8)统计分析。统计分析使用SPSS软件,版本23.0(SPSS Inc.,美国)。实验组和对照组的疟疾血症、配子体率、配子体性别比率、雄性配子体出丝数量及动合子数量使用Student’s t检验分析。卵囊密度采用Mann-Whitney U检验来分析,卡方检验用来分析感染率。数据采用平均值±标准误差(SEM)的方法表示。P0.05表示差异具有统计学意义。结果:1)Pbg37是在疟原虫有性阶段表达的高度保守蛋白。在疟原虫基因库PlasmoDB中,我们通过以下条件筛选(1)在疟原虫种属中高度保守的蛋白;(2)存在一个信号肽;(3)预测一个或多个跨膜区域和(4)主要表达在配子体阶段。在疟原虫基因库中RNA转录水平在配子体阶段大于等于97%的有13个基因。其中,我们选择PBANKA_060330做详细的功能研究。该基因编码349个氨基酸,预测蛋白分子量为40 kDa。SMART分析预测该蛋白包含一个假定的信号肽,七个跨膜区域和一个低复杂度区。BLAST多重序列比对的结果显示该基因与除疟原虫以外的生物群体无同源性,且在疟原虫种属中高度保守。由于该基因主要表达在P.berghei的配子体阶段,去除信号肽后预测的成熟蛋白的大小~37 kDa,我们给该蛋白命名Pbg37。2)rPbg37免疫小鼠后血清抗体滴度的检测。由于Pbg37预测有一个信号肽和多个跨膜域,我们在信号肽和第一个跨膜区之间选择63个氨基酸的片段(26-88个氨基酸)用于原核蛋白表达。Pbg37包含12个内含子,RT-PCR用于扩增表达的片段。含有His标签的rPbg37使用Ni-NTA亲和层析纯化,SDS-PAGE凝胶检测到一个分子量约为27.9 kDa(包含His标签)大小的条带,与蛋白预测的大小相符。rPbg37蛋白免疫小鼠后产生的多克隆抗体,通过ELISA方法检测抗体滴度。结果显示,第二次加强免疫产生的抗体滴度显著高于对照组,在最后一次免疫结束10天后抗体滴度达到1:64000。这个结果表明,rPbg37蛋白具有较高的免疫原性。3)Pbg37表达阶段的确定。为了确定Pbg37蛋白的表达阶段,等量的裂殖体、配子体、合子和动合子的溶解产物使用SDS-PAGE凝胶分离后,用抗rPbg37的鼠血清做免疫印迹。在配子体、合子和动合子的裂解产物上识别出一条大小约为~37 kDa的条带,而未在裂殖体裂解产物上发现特定条带,这与之前预测的Pbg37主要表达在有性阶段相符合,且分子量的大小也与预测的Pbg37成熟蛋白大小相符合。rHSP70蛋白免疫的血清作为阳性对照用来检测各泳道蛋白量是否相等,Pbg37在动合子上的条带略浅,表明Pbg37在动合子上表达较低。对照蛋白免疫的血清作为阴性对照均未检测到条带。由于预测的蛋白包含信号肽和跨膜区,我们想要确定Pbg37在疟原虫有性发展阶段的定位。IFA结果显示,Pbg37在裂殖体上不表达,且在配子体的表达上存在性别差异,既Pbg37在雄性配子体上表达高于雌性配子体。雄配子体出丝后Pbg37主要表达在残余体上,小配子上也能观察到荧光斑点,相比之下,大配子上具有较弱的荧光且在虫体表面参差不齐。合子表面有较强荧光强度,在向动合子转换阶段荧光信号逐渐下降。在不透膜的情况下只在配子及以后的阶段有表达,透膜后在配子体及以后的阶段均有表达,表明Pbg37的N端结构域是定位在疟原虫膜外的。对照组的血清在疟原虫的这些发展阶段均未检测到荧光信号。4)Pbg37对疟原虫有性阶段尤其是雄性配子体的发展至关重要。为了确定Pbg37在P.berghei各发育阶段的功能,我们使用双交叉同源重组的方法获得了Pbg37敲除株(Δpbg37)。转染后经乙嘧啶筛选,得到的耐药型疟原虫通过内源性PCR鉴定。以野生型作为对照分析Δpbg37(克隆KO1和KO2)的表型,Δpbg37的疟疾血症与野生型相比无显著差异,这可能由于Pbg37在无性阶段不表达。然而,Δpbg37与野生型相比显示较低的配子体率。感染后第3天配子体率达到峰值时,Δpbg37配子体率与野生型相比减少60%。此外,敲除了pbg37后显著影响了配子体的性别比例,Δpbg37雌雄配子体的比例(~6:1)显著高于野生型(~3:1)。在吉姆萨染色的薄血片中观察到,Δpbg37雄性和雌性配子体的形态与野生型不同,敲除了pbg37后雄性配子体的发展和成熟均受到影响。在感染后第三天,Δpbg37成熟的雄性配子体比例显著低于野生型组,而成熟的雌配子体的比例没有显著差异。此外,即使成熟的雄性配子体形态正常,在出丝方面也表现出缺陷。体外出丝实验,Δpbg37和野生型使用相同数量的成熟的雄性配子体,Δpbg37的出丝视野比野生型减少~36%。综上,这些表型分析结果显示,Δpbg37主要影响雄性配子体的发育和成熟。我们进一步研究了敲除pbg37后对体外受精及之后发育阶段的影响。在体外动合子培养过程中,Δpbg37和野生型使用相同数量的成熟雄性配子体培养,Δpbg37显示动合子数减少~75%,而合子和Retort的数量与野生型相比差异不大。Δpbg37和野生型感染的小鼠同时饲养蚊子,Δpbg37显示显著减少的感染率和卵囊密度。Δpbg37组蚊子感染率为68.2%远远低于野生型组(93.1%),卵囊密度由野生型组平均每个蚊中肠140.9个下降到Δpbg37组平均每个蚊中肠12.2个,平均减少了91.4%。5)抗rPbg37的血清具有明显的传播阻断能力。我们分别使用体外动合子形成和直接蚊子喂养实验来进一步确定疟原虫有性阶段表达的蛋白Pbg37的传播阻断活性。抗rPbg37的血清在1:5、1:10和1:50稀释的情况下对雄性配子体出丝的阻断能力分别为70%、65%和60%,对动合子形成的阻断能力分别为71%、58%和52%。为了确定Pbg37体内传播阻断能力,rPbg37免疫的小鼠在最后一次免疫后14天直接喂养蚊子。与对照蛋白免疫组相比,rPbg37免疫组显示轻微下降的蚊子感染率(9.23%),且卵囊密度减少了49.1%。结论:1)Pbg37编码的蛋白分子量大小为37 kDa,含有一个信号肽、七个跨膜区和一个低度复杂区。2)Pbg37主要表达在配子体阶段。3)Pbg37对疟原虫有性阶段尤其是雄性配子体的生长和发育至关重要。Pbg37敲除后与野生型疟原虫相比,显示较低的配子体率,较高的雌雄配子体比例和较低的成熟雄性配子体比例,在使用相同的成熟雄性配子体做体外培养实验时,Δpbg37的出丝视野数量及动合子数量均显著下降。4)抗rPbg37的血清有明显的传播阻断能力。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R382.31
【图文】：

疟原虫,序列比对,蛋白

3 结果3.1 Pbg37 的生物信息学分析Pbg37（PBANKA_060330）在疟原虫数据库（PlasmoDB）中被描述为“保守的疟原虫蛋白，功能未知”。Pbqsox 位于 6 号染色体 188,330 到 190,769 之间，蛋白长度为 349 aa，蛋白分子量为 40207 Da。对蛋白的结构域分析显示，Pbg37蛋白含有一个信号肽，七个跨膜区及一个低度复杂区（图 1）。对 pbg37 进行BLAST 分析后显示该基因在疟原虫种属中高度同源（图 2）。图 1. Pbg37 的蛋白结构域预测图

蛋白结构,预测图,疟原虫

中国医科大学博士学位论文3 结果3.1 Pbg37 的生物信息学分析Pbg37（PBANKA_060330）在疟原虫数据库（PlasmoDB）中被描述为“保守的疟原虫蛋白，功能未知”。Pbqsox 位于 6 号染色体 188,330 到 190,769 之间，蛋白长度为 349 aa，蛋白分子量为 40207 Da。对蛋白的结构域分析显示，Pbg37蛋白含有一个信号肽，七个跨膜区及一个低度复杂区（图 1）。对 pbg37 进行BLAST 分析后显示该基因在疟原虫种属中高度同源（图 2）。

构建模式,重组蛋白,氨三乙酸,蛋白

图 3. Pbg37 原核表达载体构建模式图。37 蛋白表达与纯化（+）- Pbg37 表达载体经 IPTG 诱导，菌体超声破碎后，在上 27.9 kDa 的蛋白条带，证明 rPbQSOX 重组蛋白主要以可溶形式g 镍氨三乙酸琼脂糖柱纯化重组蛋白，并对洗脱及透析后的样电泳检测，可清晰看到目标蛋白条带，其蛋白纯度>85%，浓度图 4）。

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