基于单细胞技术的抗ADMA兔单克隆抗体的制备

发布时间：2020-08-29 13:05

　　 [研究目的]目前心血管疾病(CVD)仍是全球疾病导致死亡的主要原因,而我国心血管疾病占城乡居民总死亡原因的首位。已有临床试验表明,内源性一氧化氮合酶(NOS)的抑制剂——不对称二甲基精氨酸(ADMA)和单甲基精氨酸(L-NMMA)可竞争抑制NOS的结合位点,减少内源性一氧化氮(NO)的产生,导致血管内皮功能障碍和心血管相关疾病的发生发展,如高脂血症、糖尿病、高血压、心力衰竭等。人体ADMA的浓度在一个狭窄的范围内,ADMA浓度的升高与增加心血管疾病的患病风险相关。现阶段检测ADMA的方法比较复杂且耗时,为ADMA检测带来了困难。相比于鼠单克隆抗体,兔单克隆抗体具有更高的亲和力和高特异性、识别更多的新型表位、可识别鼠源蛋白抗体等优点,故制备抗ADMA的兔单克隆抗体,可用来改善目前ADMA的检测技术,也可为其他临床小分子标志物单克隆抗体的制备提供新思路和帮助。同时也为临床医师提供准确、快速、稳定及可靠的检测结果,为心血管相关疾病的早期诊断、治疗提供新的依据。[实验方法]1、动物免疫与抗体效价检测使用KLH-SMCC-Cys-ADMA免疫新西兰大白兔,在检测抗体产生情况的同时,采集兔子外周血进行流式细胞分析,检测是否有抗原特异性细胞产生;采用ELISA以及Western blot进行免疫特异性和抗体效价分析。2、抗体可变区及恒定区序列的获取将兔子淋巴结和脾脏处理成单个细胞,流式分选出特异性浆细胞和B细胞,提取总RNA,利用cDNA5'末端快速扩增技术(5'RACE),合成cDNA,进行PCR获取可变区序列以及恒定区序列。3、获取抗体轻链和重链表达框将序列正确的恒定区进行PCR,利用靶向选择性联合PCR(TS-jPCR)技术连接抗体可变区和恒定区,构建轻链和重链的表达框,用于下一步蛋白表达。[实验结果]1、流式细胞分析显示在免疫前,2只兔子体内的抗原特异性B细胞百分比分别为0.946%和0.403%、抗原特异性浆细胞分别占0.403%和0.881%,存在少量的抗原特异性细胞。免疫后产生的特异性浆细胞和B细胞的百分比较免疫前有所增加,说明兔子经过免疫体内产生一定量的抗原特异性细胞。2、western blot免疫特异性分析显示,发现在64kD附近产生特异性条带,进行抗体滴度检测,1:50000稀释后非特异性结合减少,表明兔子经过免疫后产生的抗ADMA抗体特异且效价较高。3、ELISA法检测抗体效价结果显示,免疫后的OD值是免疫前OD值的2倍以上,即有差异,表明兔子免疫后产生特异性抗体同时测得效价高达1:50000。4、从摘取兔子的淋巴结和脾脏细胞进行流式细胞分选中,分选出抗原特异.性细胞利用5' RACE技术获取其可变区与恒定区序列,琼脂糖凝胶电泳结果发现可变区出现特异性条带。5、恒定区经测序结果显示,轻链恒定区与参考序列完全相符,重链恒定区与参考序列差两个氨基酸。获取恒定区表达载体框实验结果显示,通过琼脂糖凝胶电泳得出轻链的条带约在4000bp附近,重链的条带约在5000bp附近,与理论值接近。[结论]1、本课题使用的抗原能使兔子体内产生抗ADMA特异性抗体。设计的引物可成功获取抗ADMA抗体轻链和重链的恒定区序列,使用TS-jPCR连接抗体可变区和恒定区,构建轻链和重链的表达框,为下一步蛋白表达打下基础。2、可利用5' RACE技术获取抗体轻链和重链的可变区的序列,为后续获取单细胞可变区序列和进一步建立临床检验ADMA的方法打下基础。
【学位单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392-33
【部分图文】：

去上清，再用１％的ＢＳＡ－ＰＢＳ溶液轻轻重悬。逡逑）空白对照：取细胞悬液２０００于ＥＰ管中，然后加入５００（ｉｌ的１％邋ＢＳＡ－ＰＢ，置于冰上，避光，准备上机。逡逑）荧光条件的设置（见图２－ｌ）：Ｒｌ为总淋巴细胞，Ｒ２为浆细胞（ＩｇＧｌｏｗＥＲｈｉｇｇａｔｅ），然后由Ｒ２再细分到第３张图，Ｒ３为抗原特异性浆细胞，Ｃｓ（ＩｇＧｌｏｗＥＲｈｉｇｈ邋ａｎｔｉｇｅｎｍｉｄ）；邋Ｒ４邋为抗原特异性邋Ｂ邋细胞，即邋ＡＳＢＣｓ邋（ＩｇＧｌｏｇｅｎｈｉｇｈ），邋Ｒ３邋和邋Ｒ４邋均为所需细胞。通道设置：ＦＬ－１：邋ＦＩＴＣ－Ａｈｘ－Ｃｙｓ－ＡＤＭ色，ＦＩＴＣ的激发波长为４９５ｎｍ，发射波长为５１９ｎｍ，邋—般选用波长为４８８ｎｍ４：邋ＧｔＡｎｔｉ－ＲｂＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（通道为ＰＥｃｙ５．５红光激发波长为６４９ｎｍ，发射波７２ｎｍ）；邋ＦＬ－７：邋ＥＲ－ｔｒａｃｋｅｒ邋Ｂｌｕｅ－Ｗｈｉｔｅ邋ＤＰＸ邋（蓝光，激发波长约为邋３７４邋ｎｍ波长在４３０和６４０邋ｎｍ之间出现逡逑

（３）二抗孵育：加二抗（羊抗兔ＩｇＧ－ＨＲＰ，１：５０００稀释），室温２５°Ｃ孵育１小逡逑时。洗板液洗板３次，每次５ｍｉｎ，拍干。逡逑（４）加底物显色：ＡＢＴＳ？底物每孔１０００。轻轻摇匀，室温避光１０分钟，加终逡逑止液每孔５０４。逡逑（５）结果记录：ＡＢＴＳ？底物显色后，使用酶标仪在４０８ｎｍ波长读取吸光度值。逡逑三、实验结果逡逑１、流式分析结果逡逑２只兔子免疫前和４次免疫后进行流式细胞分析，检测是否产生抗原特异性逡逑细胞，每次流式分析结果见下图：逡逑

图２－３：第２８天流式分析ａ为１号兔?

【参考文献】

相关期刊论文 前4条

1 R Mitchell Baldwin;Alan Morettin;Jocelyn C?té;;Role of PRMTs in cancer: Could minor isoforms be leaving a mark?[J];World Journal of Biological Chemistry;2014年02期

2 李婷婷;崔慧斐;;兔单克隆抗体的发展及应用前景[J];食品与药品;2012年09期

3 Ayaz Ahmad;;Plant PRMTs Broaden the Scope of Arginine Methylation[J];遗传学报;2012年05期

4 宋世军;张旋;;小分子抗原免疫途径和结合数量对抗体效价的影响[J];国际检验医学杂志;2011年10期

本文编号：2808591