针对禽流感病毒H9N2亚型的单链抗体在大肠杆菌中可溶性表达与检测

发布时间：2020-09-09 22:14

　　 近年来,由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的愈演愈烈的禽流感疫情给中国及其它国家养禽业造成了巨大经济损失,并严重威胁着人类健康。H9N2是AIV一种亚型,不仅在全世界范围的禽类中广泛流行,而且可以感染人,同时还是97年香港禽流感感染人事件的H5N1 AIV内部基因的供体。在H9N2预防与免疫相关研究中,针对病毒的单链抗体(single chain antibody fragment,scFv)因其具有分子量小、穿透力强及与抗原结合力强而备受青睐。本研究从NCBI基因库中获得针对H9N2 AIV的PB2蛋白的scFv序列,拟利用具有天然表达优势的大肠杆菌体廉价制备H9N2 AIV的单链抗体。由于scFv自身结构特殊,其在大肠杆菌中的表达产物基本以包涵体形式存在,经过变性和复性过程后,蛋白活性极低。本实验将通过基因工程方法,结合表达条件优化和过程优化,促进H9N2AIVscFv在大肠杆菌中实现可溶性表达,并初步检测其与抗原PB2的结合能力。该实验首先合成针对H9N2 AIV scFv基因序列的引物,通过利用套叠PCR的方式获得H9N2 AIV scFv基因片段序列,构建至pET23a-T、pET23a-sfGFP-MAN载体中,获得重组质粒pET23a-scFv、pET23a-sfGFP-scFv。将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta Blue菌株中,诱导表达后,经SDS-PAGE检测发现H9N2AIVscFv基因序列与超折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)融合表达后,scFv可以获得部分可溶性表达,而未融合sfGFP的scFv即使经过改变温度、诱导剂浓度、培养周期,也未见可溶性表达。本实验进一步通过套叠PCR的方式合成了 H9N2 AIV的PB2蛋白基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA-DsRed载体上,获得重组真核表达质粒pcDNA-PB2-DsRed,通过Lipfectin3000转染重组质粒至HEK293T细胞表达PB2蛋白。将大肠杆菌中表达的scFv提取并纯化,与pcDNA-PB2-DsRed转染的HEK293T细胞通过蛋白质免疫印迹实验(Western Blot)和细胞免疫荧光实验检测发现,通过大肠杆菌获得的针对H9N2的可溶性scFv能与表达的PB2蛋白进行特异性识别,初步显示我们利用大肠杆菌获得的针对H9N2 AIV可溶性scFv具有生物活性,为进一步以该单链抗体建立紧急免疫接种和检测诊断方法奠定了理论基础。
【学位单位】：湖北大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392
【部分图文】：

感病毒Ｈ９Ｎ２亚型作为新型禽流感病毒的基因供体逡逑实，禽流感病毒Ｈ９Ｎ２亚型可与多种亚型重配，包括高致病性的Ｈ图１．邋２所示［５９］。类Ｇ１型的Ｈ９Ｎ２禽流感病毒可能是导致１９９７年Ｈ５Ｎ１亚型病毒的６个内部基因供体；同样也为２０１３年在中国Ｎ８病毒亚型提供了邋６个内部基因［６Ｇ］。此外，禽流感病毒Ｈ７Ｎ９亚型配，导致了多种基因型的禽流感病毒Ｈ７Ｎ９亚型。逡逑Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｎｈｕｉ／ＳＣ７０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）逡逑８０邋－邋Ａ／Ｚｈｅｊｉａｎｇ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）逡逑Ａ／ｅｒＭｒｏｎｍｅｎｔ／２ｈｅｊｉａｎｇ／ｌ８／２０１３＜ＨＳ邋Ｎ２）逡逑｜邋Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｚｈ６ｊｉａｎｇ／ＳＤ０３３／２０１３（Ｈ７Ｎ９）逡逑，Ａ／Ａｎｈｕｉ／１－ＤＥＷＨ７３０／２０１３（Ｈ７Ｎ９）逡逑１邋00邋－邋Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｙｎａｎ／Ｓ４１１１／２０１１邋（Ｈ９Ｎ２）逡逑｜—￣逦——Ａｙｊｔａｎｇｘｉ－Ｄｏｎｇｈｕ／３４６／２０１３（Ｈ１０Ｎ８）逡逑ＬＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｚｈｅ｜ｊａｎｇ／３２ｇ／２0ｌｌ（Ｈ９Ｎ２｝逡逑逦——

１ｆｅＬ逡逑Ｓ逦ｈａ２X4逡逑图１．邋１邋Ｈ９Ｎ２禽流感病毒抗原性相关的氨基酸三维图逡逑禽流感病毒Ｈ９Ｎ２亚型作为新型禽流感病毒的基因供体逡逑宄证实，禽流感病毒Ｈ９Ｎ２亚型可与多种亚型重配，包括高致病性的Ｈ６Ｎ１，邋Ｈ６Ｎ１，如图１．邋２所示［５９］。类Ｇ１型的Ｈ９Ｎ２禽流感病毒可能是导致１９９７年香港爆发流感Ｈ５Ｎ１亚型病毒的６个内部基因供体；同样也为２０１３年在中国大陆出现Ｈ１０Ｎ８病毒亚型提供了邋６个内部基因［６Ｇ］。此外，禽流感病毒Ｈ７Ｎ９亚型多次与Ｈ９Ｎ生重配，导致了多种基因型的禽流感病毒Ｈ７Ｎ９亚型。逡逑

单链抗体是一种富含二硫键的蛋白质，其功能活性依赖于二硫键的正确形成。二于单链抗体形成具有正常免疫功能的蛋白质空间构象是必需的。一般情况而言，菌细胞质内以硫氧还蛋白通路为主，胞质内表达的单链抗体中硫醇基处于还原无法形成二硫键，从而很难获得具有生物活性的单链抗体。大肠杆菌细胞周质中环境可促使硫醇基氧化，形成正确的二硫键，一般的方法诱导表达的量及其有限。逡逑有研究报道利用大肠杆菌获得禽流感单链抗体，但由于单链抗体的自身结构特点杆菌的表达蛋白的特征，大肠杆菌表达的禽流感单链抗体在胞内形成致密的包涵逡逑只有经过裂解细胞，将包涵体溶解在变性剂中，通过复性得才能得到可溶性禽流抗体蛋白，实验流程如图２．１所示。但这种方法主要的缺陷是：复性时需要经过的稀释去掉变性剂，然后进一步浓缩，过程繁琐，复性得率低（＜１５％）；另外，逡逑繁琐的复性步骤获得的禽流感可溶性单链抗体蛋白正确的空间构象不一定１００％进而影响其正常的生物活性，包括免疫活性。逡逑

【参考文献】

相关期刊论文 前7条

1 侯云霞;单链抗体的改进——ScFv多聚体[J];国外医学(免疫学分册);2001年04期

2 邱荣德,朱建蓓,王垒,吉鑫松,陆长德,袁中一;人p53蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达[J];生物工程学报;1999年04期

3 王燕,梁镇和,张友尚,崔大敷,冯佑民;人胰岛素在甲醇酵母Pichiapa storis中的分泌表达[J];生物化学与生物物理学报;1999年05期

4 刘新平，陈苏民，陈南春，赵忠良，柴玉波，崔有宏，薛泳涛;一种双顺反子表达载体的构建及应用的研究[J];生物化学与生物物理进展;1996年02期

5 李军，李伯良;蛋白A信号肽引导的E．coli外泌高表达异源蛋白[J];生物化学与生物物理学报;1995年06期

6 杨永钦;双功能抗体的研究进展[J];云南畜牧兽医;1994年02期

7 陈苏民;大肠杆菌表达质粒pSM43及pSM53的构建[J];生物化学杂志;1994年02期

本文编号：2815540