HDAC6转基因抗蓝耳病猪与Leptin基因敲除肥胖模型猪的研制
发布时间：2020-09-28 09:36
猪是人类最早驯化的动物之一,中国人驯养家猪的历史可以追溯到新石器时代。而近年来,与猪相关的研究课题一直是研究热点。一方面,猪是畜牧经济的重要物种,猪的抗病研究与人民的生产生活息息相关；另一方面,猪的生理构造与人类更接近,以猪作为模拟人类疾病模型的模式动物能帮助科学家攻克诸多疾病。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)又称蓝耳病病毒,具有超强传染性。高致病性蓝耳病会导致母猪繁殖功能障碍和仔猪死亡,对养猪业造成了巨大的经济损失。科学家们采用各种手段致力于攻克蓝耳病,但尚未取得决定性的进展。本研究中,我们试图通过转基因的方法培育自身能够抗蓝耳病的新品系猪种。过去研究发现,HDAC6是一种特殊的组蛋白去乙酰化酶,除了调控组蛋白的乙酰化水平外,其对胞质中微管蛋白的乙酰化水平同样具有调节作用。HDAC6蛋白定位在细胞质中,对细胞迁移、免疫突触形成、病毒入侵时对细胞的调节具有重要作用。因此,我们推测过表达HDAC6基因会增强动物对病毒入侵的抵抗作用。在本研究中,我们通过转基因克隆的手段,制备了过表达HDAC6转基因的猪,并通过体外细胞攻毒试验和体内攻毒试验证明了其抗病功能。首先我们构建了表达猪jHDAC'6基因的载体,通过细胞转染的方式将载体转染到猪胎儿成纤维细胞内。通过单克隆细胞筛选以及体细胞核移植的手段,得到25头F0代的过表达HDAC6转基因克隆母猪。我们选择Fo代的部分阳性克隆母猪传代配种,得到80头F1代HDAC6转基因猪。接下来通过分子检测确定了阳性率和表达量,证明了HDAC6基因过表达,实现了种系传递。我们选取PRRSA/攻毒中常用的PRRSV CH1a毒株,利用F1代猪制备的转基因阳性猪和阴性猪的肺泡巨噬细胞(PAMs),设计了24 hpi,48hpi,72 hpi三个时间点进行攻毒实验,发现攻毒后转基因阳性PAMs组的带毒量显著低于阴性PAMs组,证明了细胞水平上过表达HDAC6对PRRSV的抵抗作用。根据细胞实验的结果,我们选择4-6周的F1代仔猪共42头进行活体PRRSV攻毒试验和同居感染实验。毒株选取了在我国流行的高致病性毒株PRRSV NVDC JXAl,攻毒剂量为100 TCIDso。通过严格的个体攻毒和同居实验,我们证明了HDACt过表达转基因猪在蓝耳病病毒入侵时,能够阻碍病毒复制,延缓发病时间,减弱发病症状。实验证明过表达HDAC6转基因猪在体外攻毒实验和体内攻毒实验中均表现出对蓝耳病病毒的抗性。过去研究表明,Leptin基因(obese基因,ob)在血糖和脂肪代谢通路中起到重要调控作用。Leptin通过影响下丘脑的激素分泌,从而对食物摄入,能量消耗以及糖代谢和脂代谢起到调控作用。obese基因自然突变小鼠(ob/ob、鼠)模型由于其肥胖及相关并发症被广泛用于医学实验及药物筛选。然而Leptin突变小鼠模型在糖尿病药物临床试验中,未能反映治疗药物诱发心脏病的副作用。所以我们需要与人类生理结构更为接近的模式动物。小型猪与人类的脂肪积累方式和药物敏感度更接近。因此为了建立更适合人类肥胖症的疾病模型,本研究以小型猪为模式动物进行Leptin基因敲除。我们利用基因定点修饰的新技术锌指核酸酶敲除技术实现了Leptin基因定点突变,筛选到了11个阳性突变克隆,突变率达到了8.3%。通过体细胞移植,共获得克隆猪18头,存活11头,经过PCR测序验证,2头为双敲个体,有7头单敲个体,2头阴性个体。并且通过传代配种,获得了72头F1代Leptin基因敲除猪,其中包括35头单敲个体,37头阴性个体。通过该方法可在一年时间内获得含有两个等位基因同时发生敲除的克隆猪,极大的缩短了实验周期。Leptin双敲猪相比野生型猪表现出体型肥胖、高体脂含量、高血糖、高血脂、胰岛素抵抗等特性,符合肥胖疾病模型应有的病理特征。接下来我们将利用此疾病模型,展开更多的病理学和生理学研究。综上所述,我们通过转基因的方法建立了HDAC6过表达转基因猪,证明过表达猪的HDAC6基因对于蓝耳病病毒的入侵和复制有抵抗作用,为预防和治疗蓝耳病提供了新的思路和途径。同时我们还首次利用锌指核酸酶技术构建了Leptin敲除的肥胖疾病模型猪,为研究人类肥胖引发的相关疾病提供了新的途径。
【学位单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2014
【中图分类】：S858.28;R589.2;R-332
【部分图文】：
此后，ＰＲＲＳＶ在中国广泛流行，并产生了各种突变的毒株（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，２００６；ＧａｏｅｔａＵ逡逑２００４）。自２００６年６月Ｗ来，我国爆发了一种导致猪出现高热、皮肤发巧、离发满率和高死ｔ率逡逑的流行病，在多省市流行（图１－２）。巧致病性Xi耳病的捕状主耍巧现为楠猪持续商热，Ｗ超过４１邋Ｃ逡逑Ｈ天Ｗ上，咳嗽气喘，结膜炎，部分猪后躯无力，共济失调等症状，仔猪的发病率高达１００％，逡逑巧猪流产率也商达３０％ｙ＞上，而成年巧肥猪也可能发病致死（农业部兽医局．２００７）。根据Ｗ＿ｈ特征，逡逑我闽科学家由此分离到了新的ＰＲＲＳＶ鸿株，即高致巧性猪繁殖叫巧吸综合征病靖－ＨＰ邋ＰＲＲＳＶ。逡逑ＨＰ邋ＰＲＲＳＶ是北美亚型的一种新的突变毒株，在化ｐ２蛋白上发生了氨基酸残基的缺失突变巧ａｎ邋ｅｔ逡逑ａｌ．．邋２００７）。这次高致病性盛耳病的爆发对我园的养猪业造成了巨NB的打击，经济损失高达１００亿逡逑元人民币。自此，高致病性ＰＲＲＳＶ的研究和防治就成为
眼部出现结膜炎，眼隐水肿、分泌物多；咳嗽、气喘等呼吸道症状。部分病猪还会出现四肢乏力、逡逑颤抖，或不能站立、共济失调等神经症状。ＰＲＲＳＶ可通过血液循环穿过胎盘使胎猪受到感染，逡逑从而导致巧娠母猪出现流产，产木乃伊胎和死胎（图１－３）。高致病性ＰＲＲＳＶ具有较强的传染力，逡逑较长的流行期，在一个地区内传播数月无明显好转，常规治巧不能产生显著效果（Ｔｉａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００７）。逡逑ＰＲＲＳＶ主要通过猪之间的身体接触、粘液接触和空气传播等方式传染。其中身体接触包括逡逑共同饲养的猪互相触碰，Ｗ及其分泌物和排泄物之间的互相沾染。粘液接触范围包括猪的唾液、逡逑精液、乳汁、粪便、血液等带有病毒的分泌物。还有间接接触也可能导致Ｐ民民ＳＶ传播，比如猪逡逑场工作人员的服装、手套、鞋、帽和饲养笼、床等接触过发病猪的物品。空气传播是指在一定条逡逑件的风速、风向、湿度、温度下，ＰＲＲＳＶ可Ｗ通过空气传播到周围地区，造成大面积影响（Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ逡逑ｅｔａｌ．．邋２０１１）。因此一旦某猪场化现ＰＲＲＳＶ感染，同地区的周边猪场很容易受到传染。除此之外，逡逑猪场容易滋生的蚊陋虫等也可能作为ＰＲＲＳＶ传播的载体，病毒在家蛹体内甚至能保持活性超过逡逑１２邋ｈ。而鸟类、禽类也可能携带ＰＲＲＳＶ进行更远距离的传播（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ邋ｅｔ邋ａｈ，邋１９９７）。逡逑ＰＲＲＳＶ对养猪业带来了巨大危害
瑚逡逑、广、＾＇＇邋？产＾邋＾逡逑六’逡逑图１－２邋２００６年在中国多地爆发大规模蓝耳病事件的地点示意图（Ｔｉａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．．邋２００７）。逡逑巧ｇ．邋１－２邋Ｏｕｔｂｒｅａｋ邋ｓｉｔｅｓ邋ｏｆ邋化ｅ邋２００６邋ＰＲＲＳ邋ｅｐｉｄｅｍｉｃ邋ｉｎ邋Ｃｉｉｉｎａ（Ｔｉａｎ邋ｅｌ邋ａｌ＂邋２００７）．逡逑高致病性猪v愣〔≈沓丝桑蹋海唬槌鱿执忱抖≈⒆赐猓拱橛刑逦旅飨陨撸铮矗颍悴⒊皱义闲程欤咨希黄し舴⒑欤糠种矶俊⒈羌狻⑺闹⑽膊砍鲅⑵Ｑ首虾焐皇秤跬嘶蚍暇诲义涎鄄砍鱿纸崮ぱ祝垡住⒎置谖锒啵豢人浴⑵群粑乐⒆础２糠植≈砘够岢鱿炙闹αΑ㈠义喜叮虿荒苷玖ⅰ⒐布檬У鞯壬窬⒆础＃校遥遥樱挚赏ü貉反┕ヅ淌固ブ硎艿礁腥荆义洗佣贾虑缮锬钢沓鱿至鞑灸艘撂ズ退捞ィㄍ迹保常８咧虏⌒裕校遥遥樱志哂薪锨康拇玖Γ义辖铣さ牧餍衅冢谝桓龅厍诖ナ挛廾飨院米９嬷吻刹荒懿灾Чǎ裕椋幔铄澹澹翦澹幔欤玻埃埃罚ｅ义希校遥遥樱种饕ü碇涞纳硖褰哟ァ⒄骋航哟ズ涂掌サ确绞酱尽Ｆ渲猩硖褰哟グㄥ义瞎餐茄闹砘ハ啻ヅ觯准捌浞置谖锖团判刮镏涞幕ハ嗾慈尽Ｕ骋航哟シ段Оㄖ淼耐僖骸㈠义暇骸⑷橹⒎啾恪⒀旱却胁《镜姆置谖铩；褂屑浣咏哟ヒ部赡艿贾拢忻衩瘢樱执
本文编号：2828633
【学位单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2014
【中图分类】：S858.28;R589.2;R-332
【部分图文】：
此后，ＰＲＲＳＶ在中国广泛流行，并产生了各种突变的毒株（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，２００６；ＧａｏｅｔａＵ逡逑２００４）。自２００６年６月Ｗ来，我国爆发了一种导致猪出现高热、皮肤发巧、离发满率和高死ｔ率逡逑的流行病，在多省市流行（图１－２）。巧致病性Xi耳病的捕状主耍巧现为楠猪持续商热，Ｗ超过４１邋Ｃ逡逑Ｈ天Ｗ上，咳嗽气喘，结膜炎，部分猪后躯无力，共济失调等症状，仔猪的发病率高达１００％，逡逑巧猪流产率也商达３０％ｙ＞上，而成年巧肥猪也可能发病致死（农业部兽医局．２００７）。根据Ｗ＿ｈ特征，逡逑我闽科学家由此分离到了新的ＰＲＲＳＶ鸿株，即高致巧性猪繁殖叫巧吸综合征病靖－ＨＰ邋ＰＲＲＳＶ。逡逑ＨＰ邋ＰＲＲＳＶ是北美亚型的一种新的突变毒株，在化ｐ２蛋白上发生了氨基酸残基的缺失突变巧ａｎ邋ｅｔ逡逑ａｌ．．邋２００７）。这次高致病性盛耳病的爆发对我园的养猪业造成了巨NB的打击，经济损失高达１００亿逡逑元人民币。自此，高致病性ＰＲＲＳＶ的研究和防治就成为
眼部出现结膜炎，眼隐水肿、分泌物多；咳嗽、气喘等呼吸道症状。部分病猪还会出现四肢乏力、逡逑颤抖，或不能站立、共济失调等神经症状。ＰＲＲＳＶ可通过血液循环穿过胎盘使胎猪受到感染，逡逑从而导致巧娠母猪出现流产，产木乃伊胎和死胎（图１－３）。高致病性ＰＲＲＳＶ具有较强的传染力，逡逑较长的流行期，在一个地区内传播数月无明显好转，常规治巧不能产生显著效果（Ｔｉａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００７）。逡逑ＰＲＲＳＶ主要通过猪之间的身体接触、粘液接触和空气传播等方式传染。其中身体接触包括逡逑共同饲养的猪互相触碰，Ｗ及其分泌物和排泄物之间的互相沾染。粘液接触范围包括猪的唾液、逡逑精液、乳汁、粪便、血液等带有病毒的分泌物。还有间接接触也可能导致Ｐ民民ＳＶ传播，比如猪逡逑场工作人员的服装、手套、鞋、帽和饲养笼、床等接触过发病猪的物品。空气传播是指在一定条逡逑件的风速、风向、湿度、温度下，ＰＲＲＳＶ可Ｗ通过空气传播到周围地区，造成大面积影响（Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ逡逑ｅｔａｌ．．邋２０１１）。因此一旦某猪场化现ＰＲＲＳＶ感染，同地区的周边猪场很容易受到传染。除此之外，逡逑猪场容易滋生的蚊陋虫等也可能作为ＰＲＲＳＶ传播的载体，病毒在家蛹体内甚至能保持活性超过逡逑１２邋ｈ。而鸟类、禽类也可能携带ＰＲＲＳＶ进行更远距离的传播（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ邋ｅｔ邋ａｈ，邋１９９７）。逡逑ＰＲＲＳＶ对养猪业带来了巨大危害
瑚逡逑、广、＾＇＇邋？产＾邋＾逡逑六’逡逑图１－２邋２００６年在中国多地爆发大规模蓝耳病事件的地点示意图（Ｔｉａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．．邋２００７）。逡逑巧ｇ．邋１－２邋Ｏｕｔｂｒｅａｋ邋ｓｉｔｅｓ邋ｏｆ邋化ｅ邋２００６邋ＰＲＲＳ邋ｅｐｉｄｅｍｉｃ邋ｉｎ邋Ｃｉｉｉｎａ（Ｔｉａｎ邋ｅｌ邋ａｌ＂邋２００７）．逡逑高致病性猪v愣〔≈沓丝桑蹋海唬槌鱿执忱抖≈⒆赐猓拱橛刑逦旅飨陨撸铮矗颍悴⒊皱义闲程欤咨希黄し舴⒑欤糠种矶俊⒈羌狻⑺闹⑽膊砍鲅⑵Ｑ首虾焐皇秤跬嘶蚍暇诲义涎鄄砍鱿纸崮ぱ祝垡住⒎置谖锒啵豢人浴⑵群粑乐⒆础２糠植≈砘够岢鱿炙闹αΑ㈠义喜叮虿荒苷玖ⅰ⒐布檬У鞯壬窬⒆础＃校遥遥樱挚赏ü貉反┕ヅ淌固ブ硎艿礁腥荆义洗佣贾虑缮锬钢沓鱿至鞑灸艘撂ズ退捞ィㄍ迹保常８咧虏⌒裕校遥遥樱志哂薪锨康拇玖Γ义辖铣さ牧餍衅冢谝桓龅厍诖ナ挛廾飨院米９嬷吻刹荒懿灾Чǎ裕椋幔铄澹澹翦澹幔欤玻埃埃罚ｅ义希校遥遥樱种饕ü碇涞纳硖褰哟ァ⒄骋航哟ズ涂掌サ确绞酱尽Ｆ渲猩硖褰哟グㄥ义瞎餐茄闹砘ハ啻ヅ觯准捌浞置谖锖团判刮镏涞幕ハ嗾慈尽Ｕ骋航哟シ段Оㄖ淼耐僖骸㈠义暇骸⑷橹⒎啾恪⒀旱却胁《镜姆置谖铩；褂屑浣咏哟ヒ部赡艿贾拢忻衩瘢樱执
本文编号：2828633
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