体外培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞表型维持方法的改良

发布时间：2020-09-30 00:43

　　目的:改进大鼠AEC-Ⅱ细胞的分离方法,并对AEC-Ⅱ细胞体外培养方法进行改良,探索一种体外培养时能有效维持AEC-Ⅱ细胞表型的方法。方法:经气管持续注入0.25%胰蛋白酶和0.1%I型胶原酶消化大鼠肺组织获取大鼠AEC-Ⅱ细胞,大鼠IgG免疫粘附法、差异贴壁法提纯细胞,台盼蓝染色和流式细胞术检测细胞活力,双标免疫荧光法、透射电镜技术鉴定细胞。分离、提纯后的随机细胞分为A组(SAGM+1%FBS培养)、B组(SAGM+10%FBS培养)、C组(DMEM+1%FBS培养)、D组(DMEM+10%FBS培养)4组,分别予以不同培养基联合不同浓度的血清进行培养,于培养后的第8、10、12天收集细胞,Real-time PCR检测SP-A、SP-B、SP-C的表达以评估肺泡Ⅱ型上皮细胞表型维持情况。结果:持续气管内注入消化酶分离大鼠AEC-Ⅱ细胞,经纯化后可获得细胞产量达2×10~7-5×10~7/ml,经台盼蓝染色检测细胞活力达(91±1.7)%,流式细胞术检测细胞活力达(90.3±1.2)%,经SP-C免疫荧光染色评估细胞纯度可达(90±1.2)%。为了研究AEC-Ⅱ细胞表型维持情况,Real-time PCR检测四组细胞SP-A、SP-B、SP-C的相对表达量:(1)培养至第8天时,与A组细胞相比,B组、C组细胞表达三种物质的量明显减少,p0.05,差异有统计学意义,与B组、C组细胞比较,D组细胞表达三种物质的量明显下降p0.05,差异有统计学意义;(2)培养至第10天时,与A组细胞相比,B组、C组细胞表达三种物质的量明显减少,p0.05,差异有统计学意义,与B组、C组细胞比较,D组细胞表达三种物质的量明显下降p0.05,差异有统计学意义;(3)培养至第12天时,与A组细胞相比,B组、C组细胞表达三种物质的量明显减少,p0.05,差异有统计学意义,与B组、C组细胞比较,D组细胞表达三种物质的量明显下降p0.05,差异有统计学意义。结论:1.持续气管内注入消化酶分离大鼠AEC-Ⅱ细胞能有效提高消化效率。2.SAGM+1%FBS体外培养大鼠AEC-Ⅱ细胞时能较长时间维持其表型。
【学位单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：

细胞活力,流式细胞术,象限,台盼蓝染色

医学院硕士学位毕业论文蒲清瑚结果大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离、纯化结果经分离、纯化后每只大鼠每个肺平均可获得 AEC-Ⅱ细胞的量为 2×107-5×107n=24），经台盼蓝染色评估细胞活力达（91±1.7）%（n=24），流式细胞术评估细活力达（90.3±1.2）%（n=24），经 SP-C 免疫荧光染色评估细胞纯度可达（90±1.2）%n=12）流式细胞术检测细胞活力通过流式细胞术检测细胞的坏死和凋亡率，间接反映细胞的活力。经流式细胞评估细胞活力达（90.3±1.2）%，与台盼蓝染色评估细胞活力相当。

相差显微镜,细胞生长,培养的,大鼠

院硕士学位毕业论文蒲清相差显微镜下观察 AEC-Ⅱ细胞生长情况分离提纯后的细胞接种于培养瓶内，接种 16-24 小时细胞开始贴壁生长(a)，右细胞开始聚集在一起，呈小岛状生长（b），细胞呈圆形或立方形（AEC态学特点），胞质内含有丰富的颗粒物质，72-96 小时细胞平展呈多边形，成细胞单层（c），10 天左右无法辨认 AEC-Ⅱ细胞形态（d）。a b

细胞,免疫荧光法,免疫荧光染色,荧光显微镜

第 18 页图 3 SP-C、Cytokeratin-8 双标免疫荧光法鉴定 AEC-Ⅱ细胞：原代培养的细胞制作细胞爬片，当细胞长满爬片的 80%以上，进行免疫荧光染色，倒置荧光显微镜下观察拍片。SP-C 主要分布于细胞浆，呈颗粒型（图 B），CK-8 着色为绿色（图 C），橙色为红色和绿色的叠加（图 D）。当二者在同一细胞中表达，能充分说明该细胞为 AEC-Ⅱ。（×200）

【参考文献】