密度感应系统对弗氏志贺菌生长竞争能力的影响

发布时间：2017-04-03 05:17

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【摘要】：志贺氏菌是细菌性痢疾的主要病原体,一般感染10-100个志贺式菌就能使人发病,全世界每年的感染人数可达到1.6亿,其中发展中国家的死亡病例高达90%以上。志贺氏菌传播的主要途径是粪口,其可以入侵炎症上皮细胞,导致脓肿和溃疡等强烈的炎症反应。近年来,微生物群体间的相互作用越来越引起人们的关注,细菌所表现出的细胞相互作用,如抗生素的产生、菌体自身的发育及孢子的形成等,都需要高密度细胞共同协作完成。而密度感应系统是细菌间重要的交流系统,可通过细菌密度来调控这些协作行为。据研究显示,在基因组水平上,大肠杆菌和志贺氏菌存在同源性和相似性,但两者在表型及致病性方面表现出较大的差异。通过对比两种菌的基因序列发现:在两者的基因序列中,都含有密度感应系统操纵子基因,但两者存在一定差异。与大肠杆菌体内的密度感应系统相比,志贺氏菌体内缺少了密度感应系统的某些基因,如lsr K,lsr B,lsr F。本研究利用传统的酶切连接法构建了密度感应系统缺失基因回复株301/p Pro-lsr BFK,利用Golden Gate克隆法构建了完整密度感应系统回复株301/p ET28a-lsr KG。测定了弗氏2a志贺菌301野生株,301/p Pro-lsr BFK,301/p ET28a-lsr KG的生长曲线,比较它们在生长方面的差异;将两种不同细菌混合培养,通过菌落计数,分析判断缺失基因回复后对细菌生长优势的影响;制备野生株301、301/p Pro-lsr BFK与301/p ET28a-lsr KG的蛋白样品,进行双向凝胶电泳,比较野生株301、301/p Pro-lsr BFK与301/p ET28a-lsr KG的蛋白图谱并寻找差异蛋白点,经质谱鉴定得到差异蛋白点的信息,分析差异蛋白的可能作用。有关实验的详细结果,综合如下:1.利用酶切连接法和Golden Gate克隆法成功构建了密度感应系统缺失基因回复株301/p Pro-lsr BFK和完整密度感应系统回复株301/p ET28a-lsr KG。2.利用哈氏弧菌BB170对信号分子AI-2生物发光的特性,检测弗氏2a志贺菌301可以向胞外释放并分泌有活性的信号分子AI-2,并使哈氏弧菌BB170产生荧光。3.301/p Pro-lsr BFK、301/p ET28a-lsr KG与野生株301相比,在生长曲线上没有较大差别,但301/p Pro-lsr BFK、301/p ET28a-lsr KG菌株在稳定期达到的细菌密度更大。4.对301/p Pro-lsr BFK,301/p ET28a-lsr KG,野生株301,MG1655进行混合培养,通过菌落计数计算其生长比例,其结果表明:缺失基因回复株301/p Pro-lsr BFK与野生株301相比,不具有生长优势;而完整基因簇回复株301/p ET28a-lsr KG与野生株301相比,具有较明显的生长优势。.利用双向凝胶电泳和质谱技术,对比301/pPro-lsr BFK,5.利用双向凝胶电泳和质谱技术,对比301/p Pro-lsr BFK,301/p ET28a-lsr KG和野生株301的全菌蛋白双向凝胶电泳图谱,运用比较蛋白质组学分析差异蛋白点。结果表明:缺失基因回复株301/p Pro-lsr BFK相对于野生株301来说,蛋白差异点不明显;完整基因回复株301/p ET28a-lsr KG相对于野生株301的蛋白图谱分析,两者存在多个蛋白差异点。其中比较重要的蛋白差异点有:密度感应系统中信号分子的转运蛋白Lsr B蛋白;与蛋白折叠相关的分子伴侣蛋白Gro EL;与代谢相关的酶类,如icd A编码的异柠檬酸脱氢酶、sdh A编码的琥珀酸脱氢酶,以及与电子传递链相关的氧化还原酶,如fab I编码的NADH还原型辅酶、nuo I编码的NADH脱氢酶等。
【关键词】：弗氏志贺菌 密度感应系统 信号分子AI-2 生长优势 比较蛋白质组学
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378.25
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 引言11-18
• 1.1 志贺氏菌的简介11
• 1.2 志贺氏菌致病的毒力基因11-12
• 1.2.1 由毒力大质粒编码的侵袭区毒力蛋白11
• 1.2.2 由毒力大质粒侵袭区外部基因编码的毒力蛋白11-12
• 1.2.3 染色体上编码的相关毒力蛋白12
• 1.3 密度感应系统的简介12
• 1.4 密度感应系统信号分子在细菌中的类型12-15
• 1.4.1 I类信号系统12-13
• 1.4.2 II型信号分子系统13-14
• 1.4.3 III型诱导子系统14-15
• 1.5 密度感应系统信号分子的化学组成分类15-17
• 1.5.1 革兰氏阴性菌中AHL的类型15-16
• 1.5.2 革兰氏阳性菌中的短肽（AIP）信号分子16-17
• 1.6 本研究的目的和意义17-18
• 第二章 弗氏 2a志贺菌密度感应系统缺失基因回复株的构建及其功能研究18-38
• 2.1 研究背景18-19
• 2.2 材料19-21
• 2.2.1 质粒与菌株19
• 2.2.2 实验所用仪器和主要试剂19
• 2.2.2.1 实验中所用到的主要仪器19
• 2.2.2.2 实验中所用到的主要试剂19
• 2.2.3 培养基的配制及所用抗生素的浓度19-20
• 2.2.4 双向凝胶电泳所用试剂的配制20-21
• 2.2.5 胶内酶切相关溶液的配制21
• 2.3 方法21-29
• 2.3.1 弗氏 2a志贺菌301密度感应系统缺失基因回复株的构建21-24
• 2.3.1.1 引物设计、合成及DNA的测序21-22
• 2.3.1.2 密度感应系统缺失基因回复株 301/pPro-lsrBFK的构建22-24
• 2.3.1.3 重组质粒pPro-lsrBFK电击转化301感受态24
• 2.3.1.4 阳性克隆的筛选24
• 2.3.2 密度感应系统缺失回复株在分子水平上的验证24
• 2.3.3 密度感应系统缺失回复株与野生株 301，MG1655 生长状态的测定24-25
• 2.3.4 密度感应系统信号分子AI-2 的检测25
• 2.3.5 密度感应系统缺失回复株与野生株 301，MG1655 生长优势的比较25-26
• 2.3.6 缺失基因回复株 301/pPro-lsrBFK与野生株301比较蛋白质组学分析26-28
• 2.3.6.1 样品的制备26-27
• 2.3.6.2 双向凝胶电泳27-28
• 2.3.7 脱色及扫胶28-29
• 2.4 结果与分析29-36
• 2.4.1 密度感应系统缺失回复株的构建与验证29-30
• 2.4.2 回复株 301/pPro-lsrBFK与野生株 301，MG1655 生长状态的测定30-31
• 2.4.3 密度感应系统信号分子AI-2 的检测31-33
• 2.4.4 密度感应系统缺失回复株 301/pPro-lsrBFK与野生株 301，MG1655 生长优势的比较33-36
• 2.4.4.1 缺失回复株 301/pPro-lsrBFK与301野生株的生长优势33-34
• 2.4.4.2 缺失回复株 301/pPro-lsrBFK与MG1655 菌株的生长优势34-36
• 2.4.5 缺失回复株 301/pPro-lsrBFK与弗氏这贺菌301野生株双向电泳图谱比较 . 2936
• 2.5 讨论36-38
• 第三章 弗氏 2a志贺菌密度感应系统完整基因回复株的构建及其功能研究38-61
• 3.1 研究背景38
• 3.2 材料38-40
• 3.2.1 质粒与菌株38-39
• 3.2.2 实验所用仪器和主要试剂39
• 3.2.2.1 实验中所用到的主要仪器39
• 3.2.2.2 实验中所用到的主要试剂39
• 3.2.3 培养基的配制及所用抗生素的浓度39-40
• 3.3 方法40-45
• 3.3.1 弗氏 2a志贺菌301密度感应系统完整基因回复株的构建40-43
• 3.3.1.1 引物设计、合成及DNA的测序40
• 3.3.1.2 密度感应系统完整基因回复株 301/pET28a-lsrKG的构建40-43
• 3.3.1.3 重组质粒pET28a-lsrKG电击转化301感受态43
• 3.3.1.4 阳性克隆的筛选43
• 3.3.2 密度感应系统完整基因回复株在分子水平上的验证43
• 3.3.3 密度感应系统缺失回复株 301/ pET28a-lsrKG与野生株 301，MG1655 生长状态的测定43-44
• 3.3.4 完整基因回复株 301/ pET28a-lsrKG与野生株 301，MG1655 生长优势的比较44
• 3.3.5 完整基因回复株 301/ pET28a-lsrKG与野生株301比较蛋白质组学比较44-45
• 3.3.5.1 样品的制备44
• 3.3.5.2 双向凝胶电泳44
• 3.3.5.3 脱色及扫胶44
• 3.3.5.4 胶内酶切44-45
• 3.3.5.5 胰酶酶解肽段的质谱检测45
• 3.3.5.6 质谱检测结果的数据库查询45
• 3.3.5.7 蛋白质表达情况分析45
• 3.4 结果与分析45-56
• 3.4.1 完整基因回复株 301/ pET28a-lsrKG的构建与验证45-47
• 3.4.2 完整基因回复株 301/ pET28a-lsrKG与野生株 301，MG1655 生长状态的测定47-48
• 3.4.3 完整基因回复株 301/ pET28a-lsrKG与野生株 301，MG1655 生长优势的比较48-54
• 3.4.3.1 完整基因回复株 301/ pET28a-lsrKG与301野生株的生长优势48-51
• 3.4.3.2 301/pET28a-lsrKG与MG1655 的生长优势实验结果51-54
• 3.4.4 完整基因回复株 301/pET28a-lsrK-G与野生株301比较蛋白质组学研究54-56
• 3.4.4.1 双向凝胶电泳图谱54
• 3.4.4.2 差异表达蛋白的质谱鉴定结果54-56
• 3.5 讨论56-61
• 第四章 结论与展望61-63
• 4.1 结论61-62
• 4.1.1 构建了密度感应系统缺失基因回复株 301/pPro-lsrBFK和密度感应系统完整基因回复株 301/pET28a-lsrKG，并对其生长状态进行检测61
• 4.1.2 检测了弗氏 2a志贺菌301密度感应系统信号分子AI-2 的存在61
• 4.1.3 检测了密度感应系统缺失基因回复株 301/pPro-lsrBFK和密度感应系统完整基因回复株 301/pET28a-lsrKG，，与野生株 301，MG1655 的生长优势61-62
• 4.1.4 构建菌株的双向电泳图谱62
• 4.2 展望62-63
• 致谢63-64
• 参考文献64-70
• 附录1 作者在攻读硕士学位期间发表的论文70-71
• 附录2 实验中所用仪器设备71-72
• 附录3 实验中所用试剂72-74
• 附录4 各种试剂盒使用步骤74-77

【共引文献】

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本文编号：283793