金黄色葡萄球菌IsdB、TraP和FnBPA蛋白多表位疫苗的免疫原性研究

发布时间：2017-04-03 06:12

  本文关键词：金黄色葡萄球菌IsdB、TraP和FnBPA蛋白多表位疫苗的免疫原性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)常引起皮肤和软组织感染。由于其菌株耐药性越来越严重,使抗菌药物治疗无济于事,疫苗免疫接种便成为预防S.aureus感染的最佳选择。但由于S.aureus致病因子众多,且过去的疫苗倾向于诱导机体产生体液免疫应答,因而免疫保护效果均不理想。已经证明,CD4+T细胞免疫应答特别是Th1和Th17在预防S.aureus感染过程中发挥主要作用。因而,有必要研究S.aureus抗原启动CD4+T细胞应答的多表位疫苗的免疫原性和免疫保护作用。本研究对S.aureus IsdB蛋白的CD4+T细胞表位进行筛选,并将其与TraP蛋白的CD4+T细胞表位、TraP和FnBPA蛋白的线性B细胞表位串联,构建重组多表位疫苗,并研究其免疫原性和免疫保护作用。首先对S.aureus IsdB蛋白的二级结构及其与MHC结合能力进行预测分析,筛选合成6个可能的候选表位。将IsdB和候选表位分别与弗氏佐剂乳化后接种BALB/c和C57BL/6小鼠,检测候选表位刺激脾脏CD4+T细胞增殖及其分泌的细胞因子水平。结果,候选表位P4(287-306aa)和P1(159-178aa)可分别促进BALB/c和C57BL/6小鼠CD4+T细胞增殖并分泌高水平IFN-γ及IL-17A,与PBS组比差异极显著,而IL-4和IL-10的水平几乎保持不变。表明P4和P1主要引起Th1/Th17型免疫反应,分别属于H-2d和H-2b型CD4+T细胞表位,且高度保守。在该研究基础上,将鉴定的2个IsdB蛋白CD4+T细胞表位(P1和P4)与已获得的2个TraP的CD4+T细胞表位(TraP20-39和TraP94-113)、1个TraP的线性B细胞表位(TraP154-163)和2个FnbpA的线性B细胞表位(FnbpA352-364和FnbpA763-772)串联表达,构建成为重组表位疫苗并命名为ITF。将纯化后的ITF与弗氏佐剂乳化,以腿部肌肉注射免疫接种BALB/c和C57BL/6小鼠,检测ITF诱导机体产生免疫应答水平。结果,两种小鼠免疫ITF后均可产生强烈的细胞和体液免疫应答。S.aureus Newman株攻击后,在对照组存活率分别为10%和20%时,ITF诱导BALB/c和C57BL/6小鼠产生的免疫保护率分别为60%和70%。上述结果表明,重组表位疫苗ITF可诱导机体产生有效防御S.aureus感染的作用,为新型S.aureus疫苗研究提供参考。
【关键词】：金黄色葡萄球菌 铁离子表面决定簇B RNAⅢ激活蛋白的靶蛋白 纤连蛋白结合蛋白A T细胞表位 B细胞表位 多表位疫苗
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 符号说明10-11
• 第一章 文献综述11-21
• 1.1 引言11
• 1.2 S. aureus疫苗研究进展11-12
• 1.3 表位疫苗研究进展12-14
• 1.3.1 表位筛选及鉴定12-13
• 1.3.2 表位疫苗的构建及应用13-14
• 1.4 S. aureus致病因子14-18
• 1.4.1 S. aureus FnBPA蛋白研究进展15-16
• 1.4.2 S. aureus IsdB蛋白研究进展16-17
• 1.4.3 S. aureus TraP蛋白研究进展17-18
• 1.5 本研究的目的及意义18-21
• 第二章 S. aureus IsdB蛋白CD4~+ T细胞表位分析21-37
• 2.1 材料21
• 2.1.1 菌株和实验动物21
• 2.1.2 主要试验试剂21
• 2.1.3 试剂盒及其他21
• 2.2 方法21-26
• 2.2.1 S. aureus IsdB的CD4~+ T细胞表位预测21-22
• 2.2.2 蛋白纯化及多肽合成22
• 2.2.3 小鼠免疫22-23
• 2.2.4 抗原提呈细胞制备23
• 2.2.5 分选CD4~+ T细胞23-24
• 2.2.6 CD4~+ T淋巴细胞增殖试验24
• 2.2.7 细胞因子检测24-25
• 2.2.8 表位保守性分析25-26
• 2.2.9 统计分析26
• 2.3 结果26-34
• 2.3.0 IsdB蛋白的诱导表达与纯化26
• 2.3.1 蛋白质二级结构预测结果26-27
• 2.3.2 S. aureus IsdB的CD4~+ T细胞抗原表位在线预测结果27-29
• 2.3.3 多肽体外刺激CD4~+ T细胞增殖及细胞因子检测结果29-32
• 2.3.4 多肽体内刺激CD4~+ T细胞增殖及细胞因子检测结果32
• 2.3.5 抗原表位保守性分析32-34
• 2.4 讨论34-37
• 第三章 金黄色葡萄球菌IsdB、TraP和FnBPA蛋白多表位疫苗的免疫原性研究37-53
• 3.1 材料37
• 3.1.1 菌株和实验动物37
• 3.1.2 主要试验试剂37
• 3.1.3 试剂盒及其他37
• 3.2 方法37-44
• 3.2.1 重组基因ITF- pUC57构建37-39
• 3.2.2 重组表位原核表达载体ITF-pET32a构建39-40
• 3.2.3 重组表位原核表达载体ITF-pET32a构建及鉴定40
• 3.2.4 重组表位的诱导表达及Western blot检测40-41
• 3.2.5 动物免疫及攻毒实验41
• 3.2.6 分离小鼠脾脏淋巴细胞41-42
• 3.2.7 淋巴细胞增殖试验42
• 3.2.8 细胞因子检测42
• 3.2.9 血清抗体亚类检测42-43
• 3.2.10 调理吞噬试验43-44
• 3.2.11 统计分析44
• 3.3 结果44-50
• 3.3.1 重组表位疫苗ITF构建结果44
• 3.3.2 重组ITF诱导特异性血清抗体亚类44-45
• 3.3.3 重组ITF诱导的特异性细胞因子45-46
• 3.3.4 重组ITF诱导的特异性淋巴细胞增殖46-48
• 3.3.5 调理吞噬结果48-49
• 3.3.6 重组ITF诱导小鼠的免疫保护作用49-50
• 3.4 讨论50-53
• 第四章 全文结论53-55
• 参考文献55-63
• 致谢63-65
• 附录 165-69
• 附录 269-71
• 个人简历71

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