基于斑马鱼疾病模型研究ADAR1基因的功能

发布时间：2017-04-03 11:17

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【摘要】：目的:基于斑马鱼模型探讨ADAR1基因对遗传性对称性色素异常症(dyschromatosis symmetrica hereditaria,DSH)的影响,以及DSH患者皮损色素沉着区和色素减退区是否存在细胞凋亡,是否存在C-kit表达差异,旨在研究DSH发病机制以对其预防和治疗提供帮助。方法:(1)收集一DSH家系,并对其进行ADAR1基因测序检测致病突变(2)利用morpholino技术下调斑马鱼adar1基因表达,并在斑马鱼48hpf及72hpf两个时间点观察引起的特异性表型。(3)在48hpf及72hpf两个时间点观察各组斑马鱼尾部黑素含量。(4)各组分别收集50个样本并利用RT-PCR评估斑马鱼胚胎发育后8、16、28、32、36、52、64和76小时adar1基因表达,以证实adar1基因下调成功。(5)利用RT-PCR来探讨胚胎发育后48小时及72小时各组间wnt11、c-kit、mitf、rhoa及cdc42基因表达的差异。(6)收集DSH患者皮损标本并利用免疫组化技术探讨色素加深区和色素减退区C-kit表达的差异。(7)运用Tunel实验技术探讨DSH患者皮损色素加深区和色素减退区细胞的凋亡情况结果:(1)在DSH家系患者中发现ADAR1基因的2号外显子处存在移码突变c.1019_1020del AG(p.Gln340Argfs*5)(2)DSH斑马鱼模型成功下调adar1基因的表达。(3)72小时adar1下调组斑马鱼尾部黑色素含量明显高于空白对照组和单加吗啡琳组。(4)adar1下调组中的斑马鱼在48hpf和72hpf黑素细胞细胞极性发生改变,而在72hpf出现黑素细胞迁移和分布异常。(5)下调斑马鱼adar1基因的表达导致胚胎48hpf rhoa和cdc42的下调,72hpf wnt11的下调,48hpf及72hpf mitf、c-kit的下调。(6)C-kit表达在DSH患者皮损色素沉着区明显高于色素减退区。(7)更多的细胞凋亡现象发生在DSH患者皮损色素减退区。结论:基因测序分析在DSH家系中发现c.1019_1020del AG(p.Gln340Argfs*5)致病突变,为首次报道。斑马鱼疾病模型提示adar1基因下调后影响了黑素细胞的细胞极性和迁移,并且影响黑素母细胞的发育,人体组织标本则显示C-kit受体在色素沉着区表达明显强于色素减退区,更多的凋亡在色素减退区出现,提示色素减退区黑素细胞的过度凋亡和C-kit受体对DSH患者色素异常的发生可能起到一定的作用。
【关键词】：遗传性对称性色素异常症 斑马鱼模型 色素 C-kit受体
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R-332;R758.5
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 英文缩略语表11-14
• 第一部分 绪论14-17
• 第二部分 材料与方法17-29
• 2.1 研究对象17-18
• 2.1.1 DSH家系17-18
• 2.1.2 用于模型构建的斑马鱼采集18
• 2.2 标本收集18-19
• 2.3 实验材料19
• 2.4 主要试剂配制19-20
• 2.5 主要仪器和耗材20-21
• 2.6 研究方法21-29
• 2.6.1 患者外周血基因组DNA提取21
• 2.6.2 PCR扩增21-22
• 2.6.3 PCR产物质量评估和纯化22
• 2.6.4 测序和结果分析22
• 2.6.5 ADAR1 Morpholino设计22-23
• 2.6.6 MO显微注射条件23
• 2.6.7 确定MO显微注射剂量23
• 2.6.8 MO有效性的验证23-24
• 2.6.9 表型观察及分析24
• 2.6.10 斑马鱼组织总RNA提取24-25
• 2.6.11 RT-PCR步骤方法25-27
• 2.6.12 DSH患者皮损组织免疫组化27
• 2.6.13 DSH患者皮损组织TUNEL染色27-29
• 第三部分 结果29-42
• 3.1 DSH患者基因测序结果29-30
• 3.2 斑马鱼模型建立30-36
• 3.3 DSH斑马鱼模型各组C-kit、Mitf、Rhoa、Cdc42、Wnt11 mRNA水平检测36-39
• 3.4 DSH患者C-kit受体于皮损色素沉着和色素减退区免疫组化结果39-41
• 3.5 DSH患者于皮损色素沉着和色素减退区细胞凋亡情况41-42
• 第四部分 讨论42-46
• 第五部分 结论46-47
• 第六部分 参考文献47-50
• 在读期间发表的论文50-51
• 致谢51

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本文编号：284244