Tsc1在转录水平对树突状细胞稳态和抗原提呈功能相关基因的调控

发布时间：2020-10-13 16:01

　　 背景:树突状细胞(dendritic cell,DC)是目前公认的抗原提呈功能最强的细胞。结节性硬化症复合体1(tuberous sclerosis complex 1,Tsc1)是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)的上游关键性抑制因子,对细胞生长发育起着重要的调控作用。我们课题组前期研究表明,Tsc1在DC发育和激活中具有重要作用,并且Tsc1可通过抑制mTORC1促进T细胞稳态和应答;然而,Tsc1在转录水平对DC稳态和抗原提呈功能相关基因的调控的分子机制仍未阐明。目的:本研究通过比较特异性敲除Tsc1基因的小鼠DC与CD11c-Cre重组酶阴性对照的小鼠DC的转录谱,探究Tsc1在转录水平调控DC稳态和抗原提呈功能的分子机制。方法:(1)利用Cre-LoxP重组酶系统,通过将体内Tsc1两端均带有loxP序列的Tsc1~(f/f)转基因小鼠和在溶菌酶启动子调控下表达CD11c-cre重组酶的CD11c~(Cre)转基因小鼠(即亲代小鼠)杂交,建立CD11c-Cre重组酶阴性即未敲除DC中Tsc1且体内Tsc1两端均带有LoxP序列的纯合子对照组小鼠(Tsc1~(f/f)小鼠)和CD11c-Cre重组酶阳性即敲除DC中Tsc1且体内Tsc1两端均带有LoxP序列的纯合子小鼠(CD11c~(Cre)Tsc1~(f/f)小鼠),然后采用PCR和Western blot分别在基因水平与蛋白水平鉴定小鼠DC中Tsc1敲除情况;(2)Tsc1~(f/f)小鼠和CD11c~(Cre)Tsc1~(f/f)小鼠脾脏细胞先后经CD11c磁珠分选及流式分选仪分选后获得高纯度DC;(3)设立3组实验组,即Tsc1~(f/f)对照组、CD11c~(Cre)Tsc1~(f/f)组和体外将CD11c~(Cre)Tsc1~(f/f)小鼠脾脏DC经雷帕霉素(rapamycin,RAPA)处理组(RAPA是mTORC1特异性抑制剂,经RAPA处理以抑制mTORC1后观察mTORC1改变对Tsc1对DC调控的影响);(4)应用流式细胞术检测各组DC线粒体膜电位和膜通道孔活性、凋亡率、Ki67增殖抗原表达水平以及通过Eα多肽刺激后MHC II类复合物表达水平测定DC抗原提呈能力;(5)采用基因芯片检测3组实验组DC的全转录组基因表达,分析差异基因,经京都基因与基因组百科全书数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)和基因集富集分析(gene-set enrichment analysis,GSEA)探究DC中信号通路富集分析;(6)经实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)验证差异基因的表达水平。结果:(1)成功建立了特异性敲除DC中Tsc1的基因敲除小鼠(CD11c~(Cre)Tsc1~(f/f)小鼠),并且在基因水平以及蛋白水平验证DC中Tsc1被特异性敲除。(2)相对于Tsc1~(f/f)对照组,CD11c~(Cre)Tsc1~(f/f)组DC的凋亡率、线粒体膜电位和通透性和Ki67增殖抗原表达水平均明显增加;经RAPA处理后,DC的凋亡率和增殖抗原Ki67表达水平均降低。而且Eα多肽刺激后,CD11c~(Cre)Tsc1~(f/f)组DC的MHC II类复合物表达水平,即DC抗原提呈能力明显强于Tsc1~(f/f)对照组DC,并且可被RAPA所抑制。(3)KEGG和GSEA分析显示DC中的Tsc1对许多调控代谢的基因表达具有显著影响,这些代谢过程包括糖酵解、氧化磷酸化、脂肪酸代谢、蛋白质代谢、氨基酸代谢、tRNA转运、氨基酸转运、蛋白转运、吞噬作用和内吞作用等。(4)基因芯片检测结果显示,相对于Tsc1~(f/f)小鼠,CD11c~(Cre)Tsc1~(f/f)组小鼠DC在调控DC存活、增殖、代谢、物质转运以及抗原提呈等方面的相关基因表达水平均增加,这些基因包括Bub1b、Mad2l1、Ccnb2、Ccnb1、Casp6、Casp8、Prkaca、Cox6a2、Hk3、Ndufs8、Tpi1、Man1c1、Hpse、Nfe2l2、Renbp、Hexa、Lpin1、Acot2、Hexb、Xbp1、Nup35、Aaas、Sec61g、Nrp1、Lgmn、Cd4、Ctsb与Ctsl等;而且,CD11c~(Cre)Tsc1~(f/f)小鼠脾脏DC体外经RAPA作用、抑制mTORC1后,上述基因的改变幅度明显减弱;RT-qPCR确认了基因芯片的检测结果。结论:Tsc1可以从转录水平调控与DC存活、增殖、代谢、物质转运以及抗原提呈相关的基因表达,从而影响DC的稳态和抗原提呈功能;而且上述效应受mTORC1活性的影响。
【学位单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392
【部分图文】：

sc1 在转录水平调控 DC 稳态和抗原提呈功能的1cCre小鼠和 Tsc1f/f小鼠杂交分别建立出特异性CD11cCreTsc1f/f）和 CD11c-Cre 重组酶阴性对照f/f小鼠和 Tsc1f/f小鼠基因型鉴定C 的分离以及纯化有重要的免疫学功能，所以获得相当数量的高则十分重要。然而，我们通过小鼠 DC 流式表细胞中 DC 的比例很低，仅占 1.45%（见图 1严重影响后续实验结果；因此，我们首先通过1c+细胞；然后，再将经 CD11c+磁珠阳选后的细、MHCⅡ，通过流式分选仪获得 CD11c+MHC。通过流式检测，经过两次富集，CD11c+MH

- 27 -图 3. Tsc1 对 DC 全转录组的影响（A）火山图显示 CD11cCreTsc1f/f小鼠和对照组 Tsc1f/f小鼠 DC 中 mRNA 表达水平差异的基因（fold change> 2，P <0.05）；（B）通过 GSEA 分析 CD11cCreTsc1f/f小鼠和 Tsc1f/f小鼠 DC中信号通路富集（P <0.05）。3. Tsc1 对 DC 稳态的调控3.1 Tsc1 敲除可促进 DC 增殖，该过程受 mTORC1 影响

Ki67 是一种增殖细胞相关的核抗原,其功能与有丝分裂密切相关，其表的增殖密切相关，表达水平越高说明细胞增殖越活跃[26]。我们采用流检测 DC 胞内增殖抗原 Ki67，如图 4 所示，CD11cCreTsc1f/f小鼠 DC 高于 Tsc1f/f对照组小鼠 DC。而且，经 RAPA 作用后，CD11cCreTsc1f增殖能力减弱。这些结果表明，特异性敲除 DC 中 Tsc1 促进 DC 的增受到 mTORC1 活性影响。
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 王祖秀;郝彦哲;侯万儒;;大熊猫NADH-辅酶Q氧化还原酶铁硫蛋白亚基6基因(NDUFS6)的序列分析[J];兽类学报;2008年03期

2 ;The Phenotypic Characterization of Naturally Occurring Regulatory CD4~+CD25~+T Cells[J];Cellular & Molecular Immunology;2006年03期

本文编号：2839379