嵌合新抗原Adpgk的乙肝病毒核心抗原病毒样颗粒的构建及表达

发布时间：2020-10-14 16:57

　　 目的:制备嵌合结肠癌新抗原Adpgk的乙肝病毒核心抗原(HBcAg)病毒样颗粒(VLP)。方法:通过重叠PCR将新抗原编码序列插入截短型HBcAg(1～149 aa)第78、79位氨基酸编码序列之间,并将融合基因克隆至原核表达载体pET-22b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,利用亲和层析与超滤管纯化浓缩目的蛋白,通过Western印迹、粒径分析与透射电镜成像鉴定嵌合病毒样颗粒。结果:构建了pET-22b(+)重组表达载体并转入大肠杆菌BL21(DE3),SDS-PAGE结果显示在30℃经1 mmol/L IPTG诱导5 h即可获得高浓度的可溶性蛋白,通过亲和层析与超滤浓缩得到了纯度良好的目的蛋白;Western印迹结果表明连有His标签的目的蛋白获得表达且浓度较高;透射电镜成像可见密集的大小均一、空心的球形病毒样颗粒结构。结论:制备出浓度与纯度良好且组装正确的嵌合HBcAg VLP。
【部分图文】：

经IPTG诱导后，Adpgk-HBcAg pET-22b(+)菌体裂解沉淀中相对分子质量15×103偏上位置处出现特征条带；在Adpgk-RD-HBcAg pET-22b（+）菌体裂解上清的同样位置出现了特征条带，而其沉淀中未出现该特征条带，说明RD的引入增加了目的蛋白的水溶性。未诱导的菌体在该位置出现较浅的特征条带，应为本底表达。见图2。2.3 Western印迹检测Adpgk-RD-HBcAg重组蛋白的表达

Adpgk-RD-HBcAg pET-22b（+）重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3）感受态细胞，1mmol/L IPTG、30℃诱导5 h，菌体超声波裂解、离心后，通过Ni+亲和层析柱纯化并超滤浓缩，取菌体裂解上清与蛋白浓缩样品进行SDS-PAGE分析。图4泳道1为未经IPTG诱导的菌体裂解、离心后的上清检测结果，条带致密是因菌体内杂蛋白所致，而在预估位置未出现明显条带，表明未经IPTG诱导时目的蛋白表达量较低。泳道2为经IPTG诱导后的结果，由于蛋白未经纯化，所以条带依然非常致密，但在目的蛋白位置15×103偏上处可见一条明显的粗条带，表明IPTG诱导表达的即为目的蛋白Adpgk-RD-HBcAg，且诱导表达量较高。泳道3为诱导表达的目的蛋白经Ni+柱纯化与超滤后的结果，可见条带致密现象有明显改善，而且在预估位置有明显条带出现，说明蛋白诱导表达成功且纯化效果较好。但在泳道3中也略微可见一些其他蛋白条带，这是因为在天然菌体中也会有一些Ni+亲和的蛋白。图3 Western印迹检测Adpgk-RD-HBcAg重组蛋白的表达

Western印迹检测Adpgk-RD-HBcAg重组蛋白的表达
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本文编号：2840935