基于RNA-Seq数据的小鼠神经发育中可变剪接的研究

发布时间：2020-10-16 01:14

　　 可变剪接发生在前体m RNA向成熟m RNA的转换过程中,是转录后表达调控和产生蛋白质多样性的重要机制。可变剪接在真核生物中普遍存在,并且在生物体发育的不同阶段及不同组织或器官中,基因的剪接方式是不断变化的,以此调控细胞的增殖、分化、迁移和凋亡。神经系统发育是一个极其复杂且严密的过程,可变剪接在神经发育的各个阶段都发挥着重要的作用,特定阶段特定神经细胞内剪接方式的改变往往造成神经系统的功能异常。具有高度保守性的Smek蛋白,可以调控Wnt/Ryk信号通路影响小鼠胚胎大脑皮层早期发育。小鼠胚胎早期的神经干细胞的增殖和分化对于神经发育的正常进行至关重要,所以本论文中主要针对神经干细胞的分化过程中敲除Smek基因引起的其他相关基因的可变剪接事件,以及对神经系统发育的影响进行研究。首先采用二代测序技术对所提取的神经干细胞含ploy(A)尾的RNA构建文库,接着进行单端测序,测序数据为50bp长度的读段。样本分为两组:野生型组和敲除Smek基因组,每组三个生物学重复。同时为了更好地研究胚胎的神经干细胞分化过程中的可变剪接,分别选取神经干细胞分化第0天、第2天和第6天(测序部分由合作者完成)。然后对这些神经干细胞RNA-seq数据进行预处理,把原始序列比对到全基因组,再装配出相应的转录组,和筛选出显著性差异表达的基因、初级转录本和异构体等,为后续分析差异表达和可变剪接事件做准备。其次,采用cuffdiff对经过预处理得到的测序数据进行显著性基因差异表达的分析。筛选出具有统计学意义的显著性差异表达的基因,然后通过功能富集分析软件GO(Gene Ontology)对它们进行分析,从而得到与Smek基因相关的基因表达量变化对生物体的功能影响。同时,也研究了不同时间点敲除Smek基因和野生型中显著性差异表达的基因对神经系统发育的影响。分析结果显示,这些差异表达的基因参与了神经元的形成等,如参与神经元形成Egr2、Dlx2等基因和参与神经元分化的Miat、Gsx1等基因表达量发生了显著改变。第三,对经过预处理的测序数据,通过Jensen-Shannon差异分析方法筛选出发生可变剪接的基因,并且通过GO对这些基因进行生物学功能研究。同时,可以得到这些基因的可变剪接模式,相对于其他生物学方法只能得到一种剪接模式,本论文的方法可以分析多种模式。由分析结果可知,敲除Smek基因引起了相关基因的剪接变化,产生了不同功能的蛋白质,对神经干细胞的正常分化等过程带来影响,如Ank3、Clasp2等参与神经元分化的细胞形态的发生,Ppfibp2、Ncam1等参与神经元形成的基因翻译出不同于正常生物体的功能蛋白质。最后,总结Smek基因的生物学功能和神经发育的联系。通过分析敲除Smek基因引起相关基因发生的可变剪接,一方面可以验证Smek基因的功能,另一方面研究Smek基因在神经干细胞分化过程中的重要作用。同时本论文的研究工作,也为未来诊断和治疗与神经系统疾病奠定一定的理论基础。
【学位单位】：南京航空航天大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R3416
【部分图文】：

研究方案与创新性论文的总体研究方案在图 1.1 所描述，主要是使用生物信息学的方法来识别剪接变剪接的基因、可变剪接的模式，以及这些基因的功能富集分析，从而分析发生因对神经干细胞的分化的影响。

然后测序。在进行测序时，主出质量分数[62]。根据测序从 cDNAingle-end) 和双端(paired-end)[63]，于后续对测序数据的分析。测序过程[64]的流程图如图 3.1。

图 4.1 Basic Statistics报告 4.1，可以得知原始读段的测序平台、读段个数和序列长度等信息，此图是的一个统计。tQC 质量检测的结果报告 Per base sequence quality 如图 4.2。
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本文编号：2842521