目的:模拟人类痹证成因,建立符合中医“痹证”特点的病证结合的风湿热痹RA大鼠模型。通过秦艽寒热不同配伍药对的作用,从分子生物学角度研究秦艽及其药对对风湿热痹RA大鼠的干预作用,分析寒、热、平不同药性配伍与风湿热痹病证之间的关系,探讨药性与疾病、药性与疗效之间的关联性。方法:1.风湿热痹RA大鼠模型的建立80只SD大鼠适应性饲养1周后,采用随机数字表法分为空白组、Ⅱ型胶原组、病证模型组(Ⅱ型胶原+风湿热)、阳性药组(雷公藤多苷片组)、单味秦艽组、秦艽威灵仙组(简称秦威组)、秦艽桑寄生组(简称秦桑组)、秦艽防己组(简称秦防组),每组10只,共8组。实验第1 d,除空白组外,其余各组大鼠取背部2点(背部脊柱两侧)、尾根部1点,剃毛,皮下注射0.1 m L CⅡ乳剂,共0.3 m L致炎,实验第12 d,于大鼠左后足跖皮内注射0.1 mL CⅡ乳剂进行二次免疫,空白组在相同时间相同部位注射等量生理盐水;从首次注射CⅡ乳剂的第2 d起,除空白组和Ⅱ型胶原组外,其余各组均使用改造后的人工气候箱进行风湿热痹病证模型造模;所模拟的风湿热环境条件为:温度36~38℃,风速5 m/s,相对湿度≧95%,实验中以37℃蒸汽熏蒸,每天一次,每次30 min(其中每间隔10分钟换气一次),总共造模18 d。2.给药及一般状态观察造模结束后,各中药组按25.05 g·kg~(-1),雷公藤多苷片组按6 mg·kg~(-1)灌胃给药,空白组、Ⅱ型胶原组及病证模型组给予等量生理盐水,每天1次,连续21 d。实验中,对各组大鼠每3天测量一次体重和踝关节肿胀度,每天观察大鼠的精神状态、饮食饮水、大小便、足跖颜色以及负重前行等变化情况。3.影像学检查实验第35 d,采用多功能活体成像仪(KODAK)对各组大鼠进行活体双后肢X线拍片并解读。4.组织病理学观察实验第40 d,处死动物,每组大鼠取2只左后肢踝关节,4%多聚甲醛液固定,脱钙,常规石蜡包埋,切片,HE染色,光镜下观察关节组织形态变化。5.免疫组织化学法检测大鼠踝关节病理切片常规脱水,透明后中性树胶封片,显微镜观察,以细胞质中出现淡黄棕色至褐黄色颗粒状着色者为阳性细胞,采用IPP6.0测量踝关节中VEGF、NF-κB、MMP-1、TIMP-1被染成棕黄色颗粒的积分光密度值。6.蛋白表达水平研究采用蛋白免疫印迹技术法半定量检测各组大鼠踝关节VEGF、NF-κB、MMP-1、TIMP-1的蛋白表达量,并通过ImageJ和SPSS 21.0软件进行条带的灰度值处理和数据分析。7.基因表达水平研究采用实时荧光定量聚合酶链反应法定量检测各组大鼠踝关节VEGF mRNA、NF-κB mRNA、MMP-1 mRNA、TIMP-1 mRNA的基因表达量,并通过SPSS 21.0软件进行数据分析和处理。结果:1.一般状态观察整个实验中,空白组大鼠活跃度高,精神状态良好,毛发有光泽。造模组大鼠则在不同的阶段呈现出不同的状态:初次免疫阶段,各造模组大鼠活动较少,毛发蓬松,饮食饮水减少,左后足跖均出现不同程度的红肿,但程度较轻,不影响活动;二次加强免疫后出现严重的足跖肿胀,左足拖行或抬起,不能负重,肿胀部位明显发热、拒按,皮肤颜色由嫩红色到深红色,最后变为暗红色,触感由柔软到僵硬;大鼠争斗次数增多,烦躁,具攻击性;饮食饮水明显减少,个别尿液呈金黄色。经药物治疗后,各给药组大鼠左后足跖红肿发热均有不同程度的消退,精神状态好转,活跃程度增加,饮食饮水逐渐正常,而Ⅱ型胶原组、病证模型组未见明显改善。2.影像学检查结果空白组可见大鼠双侧踝关节关节间隙清晰,关节面光滑,骨结构正常,正常踝关节表现;Ⅱ型胶原组及病证模型组大鼠可见双侧关节周围软组织肿胀,关节间隙狭窄,且病证模型组关节间隙狭窄明显高于Ⅱ型胶原组,并有骨侵蚀病灶;各给药组大鼠可见双侧关节周围软组织肿胀消失,关节间隙狭窄明显改善,尤以秦防组最为明显,但仍有骨侵蚀病灶。3.组织病理学结果空白组关节面光滑,潮线清晰,软骨细胞排列整齐,未见炎性细胞浸润;Ⅱ型胶原组及病证模型组关节面完全破坏,骨小梁变细,髓腔变宽,大量的炎性细胞浸润,大量的肉芽组织增生,周围血管丰富并严重扩张,血管翳形成,纤维增生,且病证模型组破坏程度明显高于Ⅱ型胶原组;各给药组关节面虽然有不同程度破坏,但炎性细胞明显减少,肉芽组织中血管减少,肉芽老化,纤维增多,存在大面积修复创伤的瘢痕组织,其中尤以秦防组关节面修复较好。4.VEGF表达结果与空白组比较,Ⅱ型胶原组和病证模型组大鼠踝关节VEGF的积分光密度值、蛋白相对表达量和基因表达水平均有不同程度的升高,其中病证模型组明显高于Ⅱ型胶原组(P0.01);与病证模型组比较,各给药组VEGF的积分光密度值、蛋白相对表达量和基因表达水平均有不同程度的降低,其中秦防组明显低于其他给药组(P0.01)。5.NF-κB表达结果与空白组比较,Ⅱ型胶原组和病证模型组大鼠踝关节NF-κB的积分光密度值、蛋白相对表达量和基因表达水平均有不同程度的升高,其中病证模型组高于Ⅱ型胶原组(P0.05);与病证模型组比较,各给药组NF-κB的积分光密度值、蛋白相对表达量和基因表达水平均有不同程度的降低(P0.01);各给药组之间比较,秦防组NF-κB的积分光密度值、蛋白相对表达量降低最为明显(P0.05),而基因表达水平差异不明显(P0.05)。6.MMP-1和TIMP-1表达结果与空白组比较,Ⅱ型胶原组和病证模型组大鼠踝关节MMP-1蛋白相对表达量和基因表达水平均有不同程度的升高,TIMP-1降低,其中病证模型组MMP-1明显高于Ⅱ型胶原组(P0.05),TIMP-1低于Ⅱ型胶原组(P0.05);与病证模型组比较,各给药组MMP-1蛋白相对表达量和基因表达水平均有不同程度的降低(P0.05),TIMP-1有不同程度的升高(P0.05),其中秦防组MMP-1蛋白相对表达量明显低于其他给药组(P0.05),TIMP-1高于其他给药组(P0.05),而MMP-1基因表达水平没有显著性差异(P0.05),TIMP-1基因表达水平明显高于其他给药组(P0.05)。结论:本研究基于秦艽寒热不同配伍药对对风湿热痹RA的作用,通过影像学及组织病理学观察、免疫组织化学法检测、蛋白表达水平、基因表达水平等研究,结果表明:1.在风湿热痹RA大鼠踝关节组织中VEGF、NF-κB、MMP-1蛋白表达水平和mRNA表达水平的增高与炎症程度呈正相关性,而TIMP-1蛋白表达水平和mRNA表达与炎症程度呈负相关性。病证模型组大鼠VEGF、NF-κB、MMP-1表达升高、TIMP-1表达降低,提示关键分子的正常动态平衡表达被打破,体内的分子调节机制发生变化,从而加重病情。2.秦艽寒热不同配伍药对治疗风湿热痹RA的作用机制可能与其降低VEGF、NF-κB、MMP-1表达,升高TIMP-1表达,减少炎性细胞浸润,减少血管翳形成,降低关节软骨破坏有关。3.对风湿热痹RA大鼠的治疗,秦防组(平寒相配)能够显著降低VEGF、NF-κB、MMP-1蛋白表达水平和mRNA表达水平,升高TIMP-1蛋白表达水平和mRNA表达水平,从而减轻炎症程度,缓解软骨损伤,其效果优于其他治疗组,充分体现了中医“热者寒之”“疗热以寒药”的用药原则。
【学位单位】：甘肃中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5;R-332
【部分图文】：
第二次加强免疫后大鼠一般状况
17单味秦艽组 秦威组 秦桑组 秦防组图 1（b） 经药物治疗后各组大鼠足跖肿胀度观察Figure 1（b）After treatment with drugs,the general state of rat foot plantar in each group3.2 风湿热痹 RA 大鼠影像学结果结果如图 2 所示，空白组：可见模型大鼠双侧踝关节关节间隙清晰，关节面光滑，骨结构正常，正常踝关节表现。Ⅱ型胶原组：可见模型大鼠双侧关节周围
阳性药组：见模型大鼠双侧关节周围软组织肿胀明显消失，与空白对照组相比，关节间隙狭窄有所改善，但改善不显著，骨侵蚀病灶仍清晰可见。秦防组：见模型大鼠双侧关节周围软组织肿胀消失，关节间隙狭窄明显改善，与阳性药组比较关节间隙明显恢复。秦威组：见模型大鼠双侧关节周围软组织肿胀消失，关节间隙狭窄有所改善，但与阳性药组比较各项指标改善欠佳。其他各组与Ⅱ型胶原组及病证模型组比较关节周围软组织肿胀明显改善，但关节间隙及骨侵蚀无明显变化。空白组 Ⅱ型胶原组 病证模型组 阳性药组
【参考文献】
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1 郭亚春;梁秀军;高亚贤;宋鸿儒;;中药薯蓣皂苷元对CIA大鼠滑膜组织VEGF及AP-Ⅰ表达的影响[J];世界科学技术-中医药现代化;2015年09期
2 任丽丽;王燕;孙晓麟;王少亭;杨宏;张丽娟;张濛;;10-羟基喜树碱对类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞表达血管内皮生长因子水平的影响[J];中华医学杂志;2015年35期
3 滕英华;;类风湿性关节炎中医论治[J];中医临床研究;2013年20期
4 王钢;王丽琴;王佳;王涛;刘卓;;秦艽醇提物对胶原诱导性关节炎大鼠血清抗-CCP及TNF-α的影响[J];中国实验方剂学杂志;2013年19期
5 周涛;;类风湿关节炎滑液MMPs表达与血清免疫球蛋白的相关性研究[J];吉林医学;2013年14期
6 黄娴倩;陈勇;陈立斌;龚丽敏;谢斌华;彭勇;黄华;忻霞菲;邬秀娣;张振;;类风湿关节炎患者血清血管内皮生长因子血管生成素-1和2的检测及其与关节滑膜病变的相关性研究[J];中华风湿病学杂志;2012年10期
7 董文娟;郭亚春;宋鸿儒;;穿山龙总皂苷对CIA大鼠滑膜血管内皮生长因子及其受体Flk-1的影响[J];中国中医基础医学杂志;2012年09期
8 刘青松;朱兴春;蒋红;蔡燕;袁国华;杨明辉;张均;李君安;唐中;;丹参注射液诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞NF-κB表达研究[J];中国临床药理学与治疗学;2012年08期
9 达古拉;李鸿斌;;血管内皮细胞生长因子与类风湿关节炎发病机制及其治疗的相关性[J];中华临床免疫和变态反应杂志;2012年01期
10 程琦;宋文刚;王宁;张延新;张印坡;;类风湿性关节炎滑膜组织中VEGF表达及临床意义[J];中国当代医药;2011年25期
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2 肖玉美;CIA大鼠滑膜组织中P-P38、P-JNK通路的活化及痹肿消汤与拆方的干预作用[D];中南大学;2012年
3 付爽;MMP-1、MMP-3在早期类风湿关节炎的表达及与临床的相关性研究[D];河北医科大学;2006年
4 杨菁;雷公藤多甙在类风湿性关节炎中作用机制的研究[D];北京中医药大学;2005年
本文编号：
2844469
