TNFα通过抑制cyclin D1的泛素化降解促进未成熟支持细胞增殖并诱导大鼠BTB成熟延迟

发布时间：2020-10-19 21:45

　　 目的:在哺乳动物睾丸中,支持细胞(Sertoli cell,SC)对生殖细胞的发育至关重要,SC的最终数目决定精子的产生能力。SC增殖仅发生在胎儿和青春期前期,主要由卵泡刺激素和旁分泌因子调节,在此期间的未成熟SC可能成为影响睾丸发育的致病性因素的重要靶点。TNFα(tumor necrosis factorα)在睾丸中具有多种生物学活性,参与生精细胞发育的多个过程。SC是TNFα发挥病理或生理性作用的主要靶点。TNFα通过识别SC上的受体参与成熟BTB(blood-testis barrier)周期性重建、细胞凋亡和炎症反应。研究发现,TNFα可诱导体外培养的未成熟SC增殖,但缺乏其调节途径和作用机制研究及体内实验验证。本研究试图揭示TNFα影响未成熟SC增殖的作用机制及其对BTB成熟过程的影响。方法:1.TNFα对未成熟SC增殖的影响及泛素化PCR Array筛选差异基因。体外分离培养10 d龄SD鼠原代SC培养1-7 d,于第2 d给予不同浓度TNFα处理,于不同时间点分别采用(1)CCK-8、EdU检测细胞增殖率;(2)泛素化PCR Array筛选差异基因,qPCR验证TNFα(10 ng/ml)对Fbxo4表达影响;(3)免疫印迹检测PCNA、Fbxo4、cyclin D1表达水平;(4)免疫共沉淀检测Fbxo4与cyclin D1的相互作用及cyclin D1泛素化水平。2.Fbxo4过表达对TNFα促SC增殖效应的影响。构建含大鼠Fbxo4基因全长的腺病毒重组质粒,包装病毒颗粒后选取适宜MOI值于培养第2 d感染原代未成熟SC 24 h,于第4 d进行TNFα处理,检测细胞增殖率和相关蛋白表达量的改变。3.抑制NFκB活性对TNFα促SC增殖效应的影响。免疫印迹检测相关信号通路蛋白活性。体外培养10 d SD大鼠SC,筛选抑制NFκB通路的最佳PDTC浓度,于第2 d采用PDTC(10μM)预处理SC 2 h后加入TNFα联合处理48h,检测细胞增殖率和相关蛋白表达量的改变。4.体内研究检测TNFα对未成熟大鼠BTB功能建立的影响。体内实验选取12 d未成熟的雄性SD大鼠作为研究对象。连续3 d每天腹腔注射TNFα(10μg/kg b w),对照组注射等体积的dd H_2O,于不同时间点(16 d、20 d、24 d、26 d、30 d、32 d、35 d)进行如下实验:(1)生物素标记法检测大鼠体内BTB通透性,比较各组BTB功能成熟的时间点;(2)免疫荧光检测BTB连接蛋白分布;(3)免疫印迹检测PCNA、Fbxo4、cyclin D1和连接蛋白水平。结果:1.TNFα抑制cyclin D1泛素化并促进未成熟SC的增殖:CCK-8、EdU实验和PCNA表达水平变化显示TNFα处理明显促进未成熟SC增殖;泛素化PCR Array筛选出5个相关差异基因(3倍);免疫印迹显示TNFα显著下调E3泛素连接酶Fbxo4,而其底物cyclin D1水平升高;免疫共沉淀显示TNFα抑制了cyclin D1与Fbxo4的相互作用及其泛素化。2.Fbxo4过表达抑制TNFα对未成熟SC的促增殖作用:腺病毒Ade-Fbxo4体外感染原代未成熟SC,免疫印迹检测Fbxo4成功过表达;CCK-8和EdU试验表明,与Adv-Fbxo4组相比,Adv-Fbxo4+TNFα组细胞增殖无显著变化;免疫印迹及免疫沉淀结果显示,与Adv-Fbxo4组相比,Adv-Fbxo4+TNFα组PCNA、cyclin D1的表达水平及cyclin D1泛素化水平均无显著变化。3.TNFα通过活化NFκB促进未成熟SC的增殖:免疫印迹发现TNFα处理后p-p38/p38、p-IκBα/IκBα及p-NFκB p65/NFκB p65比值增加,说明TNFα可活化未成熟SC的p38 MAPK及NFκB通路;CCK-8及EdU试验均显示NFκB抑制剂PDTC处理后,TNFα不能促进未成熟的SC增殖(p38 MAPK抑制剂则无此效应);免疫印迹及免疫沉淀结果亦表明PDTC处理后,TNFα不再引起PCNA、Fbxo4和cyclin D1的表达水平及cyclin D1泛素化水平的明显改变。此外,Fbxo4过表达后TNFα仍能活化NFκB。4.TNFα处理未成熟大鼠引起BTB成熟滞后:体内BTB功能检测发现TNFα处理组BTB于35 dpp左右功能成熟明显晚于对照组(24 dpp)。免疫荧光显示TNFα处理后连接蛋白occludin、JAM-A在BTB的分布明显低于相同天龄的对照组。但随着大鼠天龄的增大,TNFα预处理引起的occludin、JAM-A的表达分布差异越来越小,并分别在26 dpp(JAM-A)和32 dpp(occludin)后恢复正常。结论:TNFα通过NFκB途径抑制cyclin D1的泛素化降解,进而促进未成熟SC殖并诱导大鼠BTB成熟延迟。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R321.1
【部分图文】：

中国医科大学硕士学位论文3 实验结果制 cyclin D1 泛素化并促进未成熟 Sertoli 细胞的进未成熟 Sertoli 细胞的增殖 10 dpp 未成熟 SD 鼠 Sertoli 细胞培养 1-7 天，于第 2g/ml TNFα 处理，于不同时间点（0-5 d）进行 CCK-8 细阴性对照组相比，不同处理时间和处理浓度的 TNFα 度促进作用（图 3.1）。根据该实验结果，发现 10、20、能显著的促进未成熟 SC 增殖，为达到明显的促增殖效之后的实验中均采用 10 ng/ml TNFα 处理 48 h。

图 3.2 TNFα 促进体外培养未成熟大鼠 SC 增殖（A）免疫印迹检测 TNFα 对 PCNA 蛋白水平的影响。（B）灰度值分析 PCNA 蛋白水平，*：与对照组相比 P<0.05，**：与对照组相比 P<0.01。（C）EdU 检测未成熟 SC 增殖情况，红色荧光：EdU 标记的细胞，蓝色荧光（DAPI）：细胞核，Merge：EdU 标记图和 DAPI 染核图重叠图，比例尺=50 μm。（D）统计分析 EdU 增殖实验，**：与对照组相比 P<0.013.1.2 TNFα 下调 Fbxo4 并抑制 cyclin D1 的泛素化降解由于细胞周期蛋白的水平变化与泛素蛋白酶体途径（ubiquitinproteasomesystem，UPS）密切相关，所以我们在试图深入探讨 TNFα 促未成熟 SC 增殖机制的过程中，首先采用泛素化芯片筛选相关差异基因。于是，我们从一个含有 89 个泛素相关酶的文库里筛选 TNFα 处理未成熟 SC 前后的差异表达基因，共筛选出 5 个 mRNA 差异倍数>3 的 UPS 基因（图 3.3、表 3.1）。通过查阅文献分析，我们发现泛素连接酶E3 Fbxo4 可以识别并结合细胞周期蛋白 cyclin D1，Fbxo4 的减少促使 cyclin D1 泛

15图 3.4 TNFα 抑制未成熟 Sertoli 细胞 Fbxo4 表达及 cyclin D1 泛素化（A）qPCR 检测 TNFα 处理后 Fbxo4 和 cyclin D1 的 mRNA 表达水平变化，*：与对照组相比P<0.05，**：与对照组相比 P<0.01。（B）免疫印迹检测 TNFα 处理后 Fbxo4 和 cyclin D1 的蛋白表达水平变化。（C）灰度值分析 Fbxo4 和 cyclin D1 蛋白水平，*：P<0.05，**：P<0.01。（D）免疫共沉淀检测 Fbxo4 和 cyclin D1 的相互作用以及 cyclin D1 的泛素化水平（E）灰度
【参考文献】

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1 丁思进;乔佩环;张林媛;常兵;;17β-雌二醇通过HPGA和ERα干扰睾酮合成调控精子发生[J];卫生研究;2013年03期

2 陈丽;赵岩;张蕴晖;;啮齿类动物睾丸Leydig干细胞系研究进展[J];卫生研究;2012年01期

本文编号：2847762