特异性敲除Apelin基因对单侧输尿管梗阻小鼠肾间质纤维化的影响

发布时间：2020-10-21 02:22

　　 目的观察多肽Apelin基因缺失对单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠肾间质纤维化的影响,探讨在梗阻性肾病肾纤维化形成中Apelin的作用和可能机制。方法利用CRISPR/Cas9技术构建Apelin基因敲除小鼠(KO)共20只,同时选取野生型小鼠(WT) 20只,均为8周龄雄性C57BL/6J种系,采用随机数字表法分为:KO+Sham组、KO+UUO组、WT+Sham组、WT+UUO组,每组各10只。分别对小鼠行单侧输尿管结扎(UUO)或假手术(Sham)。术后2周将小鼠处死,取血浆和手术侧肾脏进行检测。采用Masson染色观察肾脏纤维化程度,免疫组织化学染色检测肾脏基质成分纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原(Col-I)的分布和表达情况。采用Western blotting法检测肾小管上皮标志物E-钙黏素(E-cadherin)、间充质标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),以及致纤维化细胞因子--转化生长因子-β1(TGF-β1)及其受体TGFβ-R1的蛋白表达量。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血浆肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平。结果KO+UUO组小鼠肾脏可见明显的肾小管萎缩和肾间质纤维化,基质成分FN和Col-I表达量显著升高。WT+UUO组小鼠肾脏的纤维化程度和基质的表达量均低于KO+UUO组,差异具有统计学意义(P 0. 05)。KO+Sham组和WT+Sham组肾脏无明显的纤维化改变和基质的沉积。KO+UUO组小鼠,可见显著的肾小管上皮-间充质转分化(EMT)表现,E-cadherin减少,α-SMA增多,TGF-β1和TGFβ-R1受体的表达量也明显升高。与KO+UUO组相比,WT+UUO组肾小管上皮E-cadherin的表达较多,α-SMA、TGF-β1和TGFβ-R1受体的表达均较低,差异具有统计学意义(P 0. 05)。而WT+Sham组和KO+Sham组小鼠上述标志物的表达趋于正常水平。KO+UUO组小鼠血浆Cr、BUN的水平最高,WT+UUO组小鼠上述标志物的水平均低于KO+UUO组,差异具有统计学意义(P 0. 05)。KO+Sham组小鼠血浆Cr、BUN与WT+Sham组相比,差异无统计学意义(P 0. 05)。结论 Apelin在正常状态下对肾功能无明显影响,但在输尿管梗阻状态下其基因缺失可能是引起肾间质纤维化加重的因素。
【部分图文】：

采用CRISPR/Cas9技术造成Apelin基因蛋白读码框移码，功能缺失。简要过程如下:通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和gRNA;将其显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠。经PCR产物测序确认，共获得9只目的基因蛋白读码框移码的F0代小鼠。将F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配，获得4个品系共计6只阳性F1代杂合子小鼠。再将F1代小鼠分成两部分:一部分与野生型小鼠交配，扩群繁育较多的杂合子小鼠(WT);一部分自交，获得基因敲除纯合子小鼠(KD)。对小鼠进行基因敲除的效果验证和表型分析见图1。选取8周龄雄性C57BL/6J的KO小鼠和WT小鼠各20只，采用随机数字表法分为:KO+Sham组、KO+UUO组、WT+Sham组、WT+UUO组，每组各10只。对小鼠进行假手术(Sham)或单侧输尿管结扎(UUO)操作。先给予小鼠腹腔注射1%戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉，备皮并消毒皮肤，于左侧脊柱旁第13肋与大腿之间，纵行切开皮肤约1 cm，逐层分离组织，显露肾脏，UUO组结扎并离断输尿管，逐层缝合腹膜及皮肤。Sham组除不对输尿管进行结扎离断外，其余操作步骤同UUO组。所有小鼠于术后2周处死，取手术侧肾脏，将部分肾组织进行4%多聚甲醛固定、石蜡包埋及切片，待病理分析，其余部分装入冻存管中于-80℃冰箱保存，用于提取组织蛋白。

Sham组WT和KO基因型小鼠的肾脏显示，肾小球大小、形态正常，肾间质和肾小管未见明显纤维化改变。UUO组两种基因型小鼠的肾脏，部分肾小球硬化，肾间质可见炎性细胞浸润，大部分肾小管变形、扩张，纤维化明显，KO+UUO组肾脏的病变最重。半定量分析显示，与WT+UUO组比较，KO+UUO组肾间质纤维化范围增加[(50.50±4.17)%vs.(31.90±5.15)%]，差异有统计学意义(t=6.227,P<0.05)。WT+Sham组和KO+Sham组肾脏纤维化面积极低，分别为(2.46±0.57)%和(6.49±4.73)%。见图2。2.2 小鼠肾间质基质胶原的沉积

免疫组化染色显示，Sham组WT和KO基因型小鼠的肾间质中FN和Col-I仅有少量细线样分布表达。UUO组2种基因型小鼠的肾组织中，FN和Col-I在肾小管间质中呈密集的棕黄色“颗粒”状或“条索”状分布，间质细胞的胞质中也可见黄色颗粒，以KO+UUO组最明显。半定量分析结果显示，与WT+UUO组比较，KO+UUO组FN和Col-I的表达量均明显升高，差异具有统计学意义(FN:t=13.244,P<0.05;Col-I:t=9.234,P<0.05)。见图3、表1。2.3 小鼠肾小管EMT标志物的表达
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