猪胚胎干细胞不同状态表达差异比较及microRNA对诱导多能干细胞建系作用

发布时间：2020-10-21 21:24

　　 胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)以及诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)是细胞治疗、药物筛选、胚胎发育机制研究和构建体外疾病模型的重要工具。目前关于干细胞的研究主要集中在小鼠这一动物模型上。由于小鼠寿命短且其与人类生理功能及结构差异较大,使得小鼠在临床上的应用有限。与小鼠相比,猪是很好的人类疾病模型,特别是在异种移植医学、免疫及代谢疾病研究等相关方面。至今符合小鼠ESCs特点的猪ESCs系尚未成功建立,并且没有统一的猪特异性多能性分子标志用于鉴定不同状态的猪多能性干细胞。本研究将猪类na?ve状态的胚胎干细胞转化为primed状态,通过比较两者之间多能性分子标志的差异,初步确定了用于鉴定na?ve猪胚胎干细胞的特异性多能性分子标志;对本实验室已建系的猪primed胚胎干细胞、猪囊胚内细胞团及猪胎儿成纤维细胞三者之间进行micro RNA(mi RNA)表达谱的分析比较,构建特定mi RNA表达载体,研究其对猪i PSCs建系的影响。以上的研究使我们进一步了解猪多能性相关分子标记,并为mi RNA对猪i PSCs的影响提供了新的见解。目的获得能鉴别猪ESCs的多能性状态的分子标志;研究特定mi RNA对猪i PSCs细胞系建立的影响。方法1.将本实验室在LIF/3i(MEF)条件下建立的猪类na?ve ESCs(以下简称n ESCs)正常传代后,使用LIF/3i培养液培养两天后,更换为FGF/Activin(STO)条件继续培养2-3天;采用机械切割法,对形态扁平、呈片状的猪primed ESCs(reversed primed ESCs,rp ESCs)进行传代;将rp ESCs重新在LIF/3i(MEF)条件下培养,观察是否能重新获得类na?ve的状态;对第5代rp ESCs进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色,传代至第10代时对rp ESCs进行核型鉴定;通过RT-PCR检测不同状态的猪ESCs表达FGF/Activin及LIF/STAT3信号通路相关基因的情况;类胚体形成实验、三胚层相关基因表达检测及免疫荧光染色鉴定rp ESCs的体外分化潜能;荧光实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR,QPCR)检测细胞谱系及多能性相关因子在转化过程中的表达改变;利用Western blot及免疫荧光染色进一步检测n ESCs和rp ESCs中OCT4,LIN-28,CDX2,SOX17,c-MYC,NANOG,KLF4,Nr0B1,TBX3在蛋白质水平上的表达情况。2.对本实验室已建系的猪primed胚胎干细胞、猪囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM)及猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblast,PEF)三者之间进行mi RNA表达谱的分析比较,筛选出在猪内细胞团细胞中高表达的mi RNA-205。通过PCR扩增mi RNA-205前体序列,并将其克隆于基础表达载体p CAGDNA3-h Fat1,构建过表达载体p CAG-mi R205。用脂质体将该载体转染到经基因修饰的猪胎儿成纤维细胞中(含有鼠源干细胞多能性转录因子Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)。经干细胞培养液诱导培养建立猪i PSCs,利用实时QPCR检测转染前后细胞内的mi RNA-205的表达情况,比较分析mi RNA-205对猪诱导性多能干细胞的建系效率的影响。结果1.nESCs可在FGF/Activin(STO)条件下转化为rp ESCs。当rp ESCs重新在LIF/3i(MEF)条件下培养时,可重新获得类na?ve的状态的细胞,我们将其称为转化得到的na?ve ESCs(reversed na?ve ESCs,rn ESCs);rp ESCs的核型正常(38XX),AP染色呈阳性,表明rp ESCs具有自我更新能力;类胚体分化实验显示rp ESCs表达三胚层相关基因,具有体外分化能力;RT-PCR分析信号通路,结果显示primed胚胎干细胞依赖于FGF/Activin信号通路,虽然rp ESCs表达LIF/STAT3信号通路的相关因子,但Western-blot检测STAT3磷酸化结果显示,第6代的rp ESCs几乎不表达磷酸化的SATA3,说明rp ESCs不再依赖于LIF/STAT3信号通路;而n ESCs则明显依赖于LIF/STAT3信号通路。QPCR检测两种状态细胞之间多能性因子的表达差异表明,CDX2,SOX17,EOMES,FGF5,FOXA,PITX2在n ESCs中很少表达甚至不表达,而primed细胞中这些基因呈较高表达水平;LIN28,OCT4,SOX2,NOG,DPPA5,Nr0B1,KLF4在primed细胞中表达下降;NANOG,TBX3,c-MYC在primed细胞中表达上升;通过Western-blot和免疫荧光染色进一步在蛋白水平上检测两种状态下细胞中CDX2,SOX17,OCT4,NANOG,c-MYC,KLF4,Nr0B1,LIN28,TBX3的表达差异,发现与QPCR所得结果一致。2.成功构建了p CAG-mi R205过表达载体;相较于未转染细胞,转染该载体的细胞mi RNA-205表达量显著升高(P0.01);利用干细胞培养液诱导培养细胞,转染后的i PSCs克隆长出率高于未转染细胞组。结论1.本实验室建系的猪类naive ESCs可实现与primed状态细胞的互相转化,且n ESCs依赖于LIF/STAT3信号通路而rp ESCs依赖于FGF/Activin信号通路;2.通过比较两种状态细胞之间多能性分子标志的表达差异,我们初步确定了几个标准化标记来区分primed和na?ve这两种状态。细胞谱系相关基因如CDX2,SOX17,EOMES,FOXA2,以及多能性基因FGF5和PITX的表达可鉴定猪ESCs的primed状态;传统的小鼠ESCs的na?ve标记物(TBX3,Nanog和c-MYC)也可作为猪ESCs的primed状态的分子标志。此外,多能性基因(Lin28,Oct4,SOX2,NOG,DPPA5,Nr0B1,KLF4)可以作为猪ESCs的na?ve状态的分子标志。3.已构建的mi RNA-205过表达载体将有助于在后续研究中建立稳定表达mi RNA205的细胞系,为进一步深入研究mi RNA205在干细胞重编程和多能性维持中的作用机制奠定基础。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：

29图 1.（A）nESCs 和 rpESCs 的形态。Scale bars=250 um （B）nESCs 和 rpESCs 克隆的碱性磷酸酶染色。 Scale bars=100 um （C）用 LIF / 2i 条件下（猪 na veESCs 培养液）将酶消化后的 rpESCs 接种于 MEF饲养层上培养 4 天，转化为 rnESCs。 Scale bars=250 um（D）第 10 代 rpESCs 的核型分析结果显示，超过 72％的细胞显示 38 条染色体的正常猪核型。（E）RT-PCR 检测第 22 代 nESCs 、第 3 和第 6 代 rpESCs、第 3 代 rnPESCs 中信号通路相关基因表达情况(LIF，LIFRα， LIFRβ， STAT3，gp130b，FGF， FGFR1，FGFR2， Activin-A and Nodal)。（F）第 22 代 nESCs 、第 3 和第 6 代 rpESCs 及 PEF 中的 STAT3 的磷酸化状态，其中以 PEF 作为阴性对照。

31图 2.（A）对第 12 代的 rpESCs 进行悬滴培养 7 天，体外分化形成类胚体，。Scale bars=100 um （B）EB 在明胶预处理的培养皿上贴壁培养，可见分化细胞向周边扩展。Scale bars=100 um（C）在 EB 中检测到 NCSIN（内胚层），OSTEONECTIN（中胚层）和 NEUROD（外胚层）的表达。水作为阴性对照。 （D）对 rpESCs 来源的分化细胞进行 Keratin （内胚层）， Desmin（中胚层）和 Neurofilament （外胚层）进行免疫荧光染色。PI 用于细胞核染色。Scale bars=50 um。

南京医科大学硕士学位论文显着的下降趋势（图 4A，4C 和图 5）。KLF4，ESRRB，PRR13 和 PECAM-1在转化过程中表现为波动性表达（图 4B）。由于 nESCs 克隆形态与小鼠 ESCs 相似，而 rpESCs 在形态上接近人ESCs[40]。因此，我们假定 nESCs 的多能性因子表达作为猪 na ve ESCs 的分子特征。对于小鼠 ESCs 来说，MYC，TBX3 和 NANOG 是调控多能性的核心转录因子，对于维持 na ve 状态 ESCs 的自我更新至关重要。本实验中 QPCR 结果显示，MYC，TBX3 和 NANOG 在 rpESCs 中表达显著上调，而在 nESCs 中几乎检测不到（图 6A）。蛋白质印迹和免疫荧光染色实验也进一步证实了这一结果（图 6B 和图 6C）。
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