毒胡萝卜素诱导内质网应激对调节性T细胞功能影响及机制的初步研究

发布时间：2020-10-22 23:04

　　 背景调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)是一类具有显著免疫调节功能的CD4+T细胞亚群,通过抑制树突状细胞(DC)、T细胞等免疫细胞的功能活性在脓毒症免疫紊乱中发挥关键调节作用。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是在多种生理或病理条件下引起内质网(ER)腔内未折叠蛋白或错误折叠蛋白聚集,导致ER功能受损的状态。研究发现脓毒症可诱发机体发生ERS反应,通过调控多种免疫细胞功能,在免疫炎症反应中发挥重要作用。尽管目前已经明确Treg在脓毒症免疫紊乱中发挥关键作用,ERS是否影响Treg细胞的功能及机制,目前尚未见研究报道。目的采用ERS特异性诱导剂毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)刺激正常及内毒素(LPS)体外模拟脓毒症刺激条件下的小鼠脾脏Treg细胞,旨在探讨ERS对Treg细胞功能的影响及其机制。方法1、免疫磁珠法分离正常BALB/C小鼠脾脏Treg细胞及CD4+T细胞,流式细胞术鉴定Treg细胞纯度。依TG(0.1μmol/L)刺激的时间不同分为0、6、12、24h组,依TG刺激的浓度不同设为0、0.05、0.1、0.2μmol/L组,刺激12h后,流式细胞术检测Treg Foxp3及CTLA-4表达的时间/剂量效应关系,确定最佳实验浓度及时间。2、给予TG刺激后,分别采用共聚焦显微镜检测内质网形态、蛋白印迹分析(Western blot)检测PERK信号通路GRP78、PERK、eIF2α、ATF4的表达变化,评价TG诱导Treg ERS的状态,分别采用流式细胞术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、CFSE示踪染料标记法检测Treg的Foxp3及CTLA-4表达、细胞因子分泌、Th1/Th2分化及对Teff的增殖抑制反应,评价Treg的功能状态,并结合PERK信号通路抑制剂(GSK2656157),分析阻断PERK信号通路后,Treg的功能变化,探讨ERS调节Treg功能的分子机制。3、给予LPS模拟体外脓毒症刺激,应用TG后,应用上述实验方法检测Treg细胞内GRP78、PERK、eIF2α、ATF4的表达、Foxp3 CTLA-4的表达、细胞因子分泌、Th1/Th2分化及对Teff的增殖抑制反应以及应用GSK2656157对Treg功能活性的影响,分析体外脓毒症状态下,ERS对Treg功能状态的影响和可能作用靶点。结果1、采用免疫磁珠分选得到Treg和Teff的纯度分别为91%、88.2%,符合后续实验要求;检测Foxp3及CTLA-4的表达的时效量效关系,结果表明,TG0.1μmol/L作用12h,Foxp3的表达变化最为显著,故选择TG0.1μmol/L、12h用于后续实验。同时,本研究显示上述作用浓度及时间,Treg CTLA-4的表达均无明显变化。2、给予TG刺激后,激光共聚焦显微镜检测Treg内质网形态发生改变,内质网碎裂、膨胀、并偏向核一侧聚集;GRP78、PERK、ATF4及eIF2α的磷酸化水平显著上调,同时Treg Foxp3表达,IL-10和TGF-β的分泌均明显增加,与Treg共培养的Teff增殖活性受到明显抑制,培养上清中IL-4/IFN-γ比值明显升高,IL-2生成下降(P0.05),而给予阻断剂GSK2656157后Treg Foxp3表达,IL-10和TGF-β的分泌均明显降低,与Treg共培养的Teff增殖活性抑制情况减弱,共培养上清中IL-4/IFN-γ比值降低,IL-2生成增加(P0.05)。3、LPS刺激Treg模拟体外脓毒症状态下,给予TG刺激后,GRP78、PERK、ATF4及eIF2α的磷酸化水平显著上调,同时Treg Foxp3表达,IL-10和TGF-β的分泌均明显增加(P0.05),与Treg共培养的Teff增殖活性受到明显抑制,培养上清中IL-4/IFN-γ比值明显升高,IL-2生成下降(P0.05),提示TG在LPS协同作用下进一步增强Treg免疫抑制活性;而给予阻断剂GSK2656157后检测到GRP78、PERK、ATF4及eIF2α的磷酸化水平显著下降,Treg Foxp3表达,IL-10和TGF-β的分泌均明显降低(P0.05),与Treg共培养,Teff的增殖活性抑制情况减弱,培养上清中IL-4/IFN-γ比值降低,IL-2生成增加(P0.05)。结论ERS是细胞应对内外环境刺激下的一种保护性机制,研究表明ERS对免疫细胞的功能状态具有重要调节效应。本研究结果显示:1、给予ERS诱导剂TG刺激后,内质网形态发生改变,内质网碎裂、膨胀、并偏向核一侧聚集;GRP78、PERK、ATF4及eIF2α的磷酸化水平显著上调,提示TG诱导ERS反应发生,Treg Foxp3表达,IL-10和TGF-β的分泌均明显增加,Teff的增殖活性受到明显抑制,培养上清中IL-4/IFN-γ比值明显升高,IL-2生成下降,提示TG诱导的ERS可明显增强Treg的功能活性,而应用PERK抑制剂后,Treg的功能活性显著降低,提示PERK信号途径是影响Treg功能的可能作用靶点。2、LPS刺激Treg模拟体外脓毒症条件下,给予TG刺激,活化PERK信号通路诱导ERS反应的同时,进一步增强Treg的功能活性,而给予PERK抑制剂后,通过阻断PERK信号通路上分子的表达,下调Treg功能。提示ERS可能通过PERK信号通路调节Treg的免疫活性参与脓毒症免疫紊乱的发生发展,而阻断Treg PERK信号通路可能为脓毒症免疫紊乱的治疗提供潜在作用靶点。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392
【部分图文】：

津医科大学硕士学位论文 一、毒胡萝卜素诱导的 ERS 对调节性 T 细胞免疫功能的将之前实验收集的细胞培养上清从-20℃冰箱取出，室温溶解，采用 ILF-β、IL-4、IFN-γ、IL-2 ELISA 检测试剂盒检测相应细胞因子的分泌情况（操作方法严格按照各 ELISA 试剂盒操作说明进行），尽量减少人为误差。.9 统计学处理采用 SPSS19.0 统计分析软件对实验数据进行统计分析，计量资料结果以!未找到引用源。±s 表示，单因素多组数据方差分析对组间差异进行比较结果之间比较采用成组 t 检验，当 P<0.05 时，差异被认为具有统计学意义2 结果.1 小鼠脾脏Treg分选纯度及细胞活性检测如图 1.1 所示，小鼠脾脏单个核细胞经过两次 MACS 分选后，得到 CD4的纯度为 88.2%，Treg 纯度为 91%，台盼蓝染色检测细胞活性大于 95%。

与对照组相比较：*P<0.051.2 流式检测 TG 刺激对 Treg Foxp3 及 CTLA-4 表达的时间-剂量效应关系 TG刺激对内质网形态变化的影响如图 1.3 所示：与正常对照组比较，TG 刺激可诱导 Treg 细胞内质网形态，内质网聚集、膨胀、碎裂，并偏向核一侧聚集，内质网形态发生明显适变化。提示 TG 0.1μM 刺激 12h 可显著诱导 Treg 细胞发生应激性改变。

组相比较：*P<0.05式检测 TG 刺激对 Treg Foxp3 及 CTLA-4 表达的时间-剂量效激对内质网形态变化的影响.3 所示：与正常对照组比较，TG 刺激可诱导 Treg 细胞内质网聚集、膨胀、碎裂，并偏向核一侧聚集，内质网形态发生提示 TG 0.1μM 刺激 12h 可显著诱导 Treg 细胞发生应激性改
【参考文献】

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本文编号：2852202