改良联合酶消化法制备人瘢痕疙瘩组织单细胞悬液的实验研究
发布时间：2020-10-26 07:28
目的探讨改良的联合酶消化法对于瘢痕疙瘩真皮组织的消化效果,并探究最佳消化时间。方法收集瘢痕疙瘩样本8例,去除表皮后用剪刀将真皮组织匀浆。真皮匀浆采用A、B两种方案进行消化。A方案采用传统的联合酶消化法(Ⅰ型胶原酶+Ⅱ型胶原酶+Ⅳ型胶原酶+透明质酸酶);B方案采用改良联合酶消化法,在A方案的基础上添加了DNaseⅠ。采用显微镜计数单细胞占比和单细胞数,台盼蓝染色和流式细胞检测细胞活性,比较A、B两种消化方案的消化效率,同时探究B方案的最佳消化时间。结果消化2 h和4 h后,B方案相比A方案获得的单细胞比例显著升高(P0.05),单细胞数显著增多(P0.01)。应用B方案,消化时间延长至6 h,相比消化4 h得到的单细胞比例和单细胞数显著增加(P0.05),细胞活性无明显改变(P0.05)。消化时间延长至8 h和10 h,与6 h相比,单细胞比例和单细胞数无明显增加(P0.05),细胞活性显著下降(P0.05)。结论在传统联合酶消化液中添加DNaseⅠ能够提高消化效率,有效制备疤痕疙瘩组织的单细胞悬液。组织消化6 h能够在保持细胞活性的同时达到较好的消化效果。
【部分图文】：
Masson染色显示瘢痕疙瘩组织最为特征性的改变是真皮深层细胞增生活跃、胶原高度沉积的增生结节区，该区胶原纤维排列紊乱，形成粗大的纤维条索和结节。这提示在制备单细胞悬液的过程中，需要大量降解胶原成分的酶，以释放包裹于致密细胞外基质中的细胞（图1）。2.2 A组和B组消化效率的比较
目前，皮肤组织的消化没有固定的方案，最为常用的是酶消化法。中性蛋白酶能有效降解细胞和细胞外基质间的连接蛋白，对细胞间连接和细胞本身几乎不造成影响，故常被用于表皮和真皮的分离[14]。胶原是真皮组织中主要的细胞外基质成分。因此，真皮组织的消化主要依赖各种类型的胶原酶。其中，有采用单一类型的胶原酶（如Ⅰ型胶原酶[10]或Ⅳ型胶原酶[11]）对瘢痕疙瘩组织进行消化，也有使用粗制的混合胶原酶[12]（包含Ⅰ型、Ⅱ型胶原酶等）进行消化。但是，由于其目的在于提取成纤维细胞，因而在单细胞比例上没有明确要求，消化得到的细胞悬液中包含大量细胞团块，无法达到单细胞悬液的制备要求。近年来，随着单细胞检测技术的兴起，人们对真皮组织的消化程度提出了更高的要求。相继有研究报道了正常皮肤单细胞悬液的制备方法，能够满足常规流式细胞检测和单细胞测序的要求[4-6,13]。其中主要的消化方式分为两种：一种是皮肤消化试剂盒（Whole skin dissociation kit）和配套的组织消化仪（gentleMACS Dissociator)[4-5]，另一种是联合酶消化法[6,13]。由于条件限制，本研究并未购置组织消化仪，因此主要讨论联合酶消化法及其改进方案。联合酶消化法采用混合酶溶液（1.25 mg/mLⅠ型胶原酶、0.5 mg/mLⅡ型胶原酶、0.5 mg/mLⅣ型胶原酶和0.1 mg/mL透明质酸酶）在37℃消化真皮组织1 h，可以将组织有效消化，消化后的细胞表面抗原，如成纤维细胞抗原CD90、FAP、CD36等保存良好，能够进行后续的流式细胞检测和原代细胞培养[6]。但是，该方案在消化瘢痕疙瘩时显得效率不足，预实验结果显示，经过1 h的消化，细胞悬液中仍有大量聚集的细胞团，提示消化不完全。为了获得更好的消化效果，必须对联合酶消化法进行改进。图3 B组消化4 h、6 h、8 h和10 h的组织消化效果
B组消化4 h、6 h、8 h和10 h的组织消化效果
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本文编号：2856697
【部分图文】：
Masson染色显示瘢痕疙瘩组织最为特征性的改变是真皮深层细胞增生活跃、胶原高度沉积的增生结节区，该区胶原纤维排列紊乱，形成粗大的纤维条索和结节。这提示在制备单细胞悬液的过程中，需要大量降解胶原成分的酶，以释放包裹于致密细胞外基质中的细胞（图1）。2.2 A组和B组消化效率的比较
目前，皮肤组织的消化没有固定的方案，最为常用的是酶消化法。中性蛋白酶能有效降解细胞和细胞外基质间的连接蛋白，对细胞间连接和细胞本身几乎不造成影响，故常被用于表皮和真皮的分离[14]。胶原是真皮组织中主要的细胞外基质成分。因此，真皮组织的消化主要依赖各种类型的胶原酶。其中，有采用单一类型的胶原酶（如Ⅰ型胶原酶[10]或Ⅳ型胶原酶[11]）对瘢痕疙瘩组织进行消化，也有使用粗制的混合胶原酶[12]（包含Ⅰ型、Ⅱ型胶原酶等）进行消化。但是，由于其目的在于提取成纤维细胞，因而在单细胞比例上没有明确要求，消化得到的细胞悬液中包含大量细胞团块，无法达到单细胞悬液的制备要求。近年来，随着单细胞检测技术的兴起，人们对真皮组织的消化程度提出了更高的要求。相继有研究报道了正常皮肤单细胞悬液的制备方法，能够满足常规流式细胞检测和单细胞测序的要求[4-6,13]。其中主要的消化方式分为两种：一种是皮肤消化试剂盒（Whole skin dissociation kit）和配套的组织消化仪（gentleMACS Dissociator)[4-5]，另一种是联合酶消化法[6,13]。由于条件限制，本研究并未购置组织消化仪，因此主要讨论联合酶消化法及其改进方案。联合酶消化法采用混合酶溶液（1.25 mg/mLⅠ型胶原酶、0.5 mg/mLⅡ型胶原酶、0.5 mg/mLⅣ型胶原酶和0.1 mg/mL透明质酸酶）在37℃消化真皮组织1 h，可以将组织有效消化，消化后的细胞表面抗原，如成纤维细胞抗原CD90、FAP、CD36等保存良好，能够进行后续的流式细胞检测和原代细胞培养[6]。但是，该方案在消化瘢痕疙瘩时显得效率不足，预实验结果显示，经过1 h的消化，细胞悬液中仍有大量聚集的细胞团，提示消化不完全。为了获得更好的消化效果，必须对联合酶消化法进行改进。图3 B组消化4 h、6 h、8 h和10 h的组织消化效果
B组消化4 h、6 h、8 h和10 h的组织消化效果
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