生殖支原体黏附蛋白MgPa互作蛋白的筛选与鉴定及其功能的初步研究

发布时间：2020-10-30 00:48

　　 研究背景:生殖支原体(Mycoplasma genitalium,Mg)是一类缺乏细胞壁、能在无生命培养基中生长繁殖的最小原核细胞型微生物。其主要黏附蛋白MgPa(M.genitalium protein of adhesion,MgPa)是Mg黏附并入侵宿主细胞的关键因素。Mg可经MgPa与宿主细胞发生相互作用,然而国内外尚未见关于MgPa互作蛋白研究的报道,且对MgPa生物学功能研究较少。支原体与宿主细胞间的相互作用是支原体致病的关键。本研究通过噬菌体展示技术从人尿道上皮细胞(SV-HUC-1)T7噬菌体展示cDNA文库中筛选与鉴定与MgPa相互作用的蛋白,并通过串联质谱标签(Tandem Mass Tags,TMT)标记的蛋白定量法研究发生互作后差异蛋白的表达,为了解MgPa的功能,进一步研究Mg的致病机制提供实验基础。研究目的:从人尿道上皮细胞(SV-HUC-1)T7噬菌体展示cDNA文库筛选与鉴定Mg黏附蛋白MgPa的互作蛋白,进一步研究互作后对细胞功能的影响,为深入了解MgPa的生物学功能以及Mg的致病机制奠定实验基础。研究方法:(1)SV-HUC-1 T7噬菌体cDNA初始文库的扩增。(2)SV-HUC-1 T7噬菌体cDNA文库与MgPa互作蛋白的亲和筛选、PCR扩增、DNA测序与BLAST分析。(3)间接酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点免疫印迹验证阳性噬菌体与rMgPa的特异结合。(4)Far-western blot检测RPL35与rMgPa的特异结合。(5)构建MgPa真核表达载体,通过间接免疫荧光鉴定RPL35和MgPa在细胞内的互作。(6)TMT法筛选pcDNA3.1(+)/MgPa转染前后的差异蛋白。(7)实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测pcDNA3.1(+)/MgPa转染前后表皮生长因子(EGF)、真核翻译起始因子(EIF2)、信号识别颗粒因子(SRP68)、纤溶酶原激活物抑制物1 RNA结合蛋白(SERBP1)、核糖体蛋白(RPL35A)和转化生长因子(TGF-β1)mRNA表达水平,并通过MTT法检测转染后细胞的增殖情况。研究结果:(1)SV-HUC-1 T7噬菌体cDNA初始文库扩增后滴度为3x10~8pfu。(2)经过4轮的生物淘选,噬菌体产率从第一轮筛选的0.67×10~(-4)到第4轮筛选的1.7×10~(-3),表明与rMgPa特异结合的噬菌体明显得到富集。(3)PCR扩增阳性噬菌体,送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序,经BLAST比对分析,结果表明随机挑取的32个阳性克隆包括7种不同序列,即代表7种不同的蛋白,将7种序列分别用P1至P7进行编号,其中以RPL35重复次数最多,其重复率达62.5%。(4)间接ELISA法检测代表性噬菌体与rMgPa的结合情况,结果表明7种噬菌体均能与rMgPa特异结合,其中P1(RPL35)、P2(Mitochondrio complete genome)和P3(RPN4)与MgPa结合力较强。(5)用斑点免疫印迹法进一步检测阳性噬菌体能否与rMgPa特异结合,结果表明P1、P2和P3代表性噬菌体出现了明显的斑点,说明P1、P2和P3能与rMgPa特异结合,与间接ELISA法结果一致。(6)Far-western blot方法进一步检测SV-HUC-1细胞总蛋白中RPL35与rMg Pa的结合情况,结果显示在约37 KDa处出现明显条带,说明细胞总蛋白中的RPL35能与rMgPa特异结合。(7)以MgPa基因序列(3223~4092,870bp),构建pcDNA3.1(+)/MgPa真核表达载体,通过双酶切和PCR鉴定证实MgPa真核表达载体构建成功。(8)用间接免疫荧光法(IF)检测Mg是否能侵入SV-HUC-1细胞,结果表明Mg能入侵宿主细胞内。(9)将pcDNA3.1(+)/MgPa转染至SV-HUC-1细胞,SDS-PAGE和Western blot的结果表明真核表达载体在细胞中转染成功。(10)间接免疫荧光试验的结果说明pcDNA3.1(+)/MgPa转染成功且RPL35与MgPa在SV-HUC-1中能共定位,表明RPL35与MgPa能在细胞内相互作用。(11)TMT蛋白定量法结果表明:与正常组相比,pcDNA3.1(+)/MgPa转染24h组有401个蛋白上调,6个蛋白下调。(12)实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的结果表明:与正常组相比,pcDNA3.1(+)/MgPa转染组EGF、EIF2、SRP68、SERBP、RPL35A和TGF-β1出现不同程度的增高。(13)MTT法检测转染后24h至48h细胞出现增殖,72h后细胞增殖受到抑制。结论:(1)60S核糖体蛋白L35(RPL35)可能是MgPa的互作蛋白。(2)MgPa与RPL35互作可上调细胞转录起始与翻译相关蛋白的表达,促进细胞增殖。
【学位单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R375
【部分图文】：

第 4 章 实验结果第 4 章 实验结果C-1 T7 噬菌体展示 cDNA 文库得到扩增前期构建的SV-HUC-1 T7噬菌体展示cDNA文库在宿主菌菌体文库稀释成不同的倍数，在含羧苄青霉素的 L 37℃温箱培养过夜，计算扩增后的滴度为 3×108pfu，结增的噬菌体文库具有较高的滴度。102104

表 2.1 亲和筛选噬菌体的投入量、产出量及其比值Tab 2. 1 Theinput, output of phages and ratio for affinity screening4.2.2 PCR 扩增噬菌体的外源基因为扩增噬菌体含有的外源基因，对从第 4 轮筛选的平板上随机挑取的 32 个噬菌斑进行 PCR 扩增，PCR 产物采用 1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示成功提取到 32 个噬菌体的外源 DNA，其片段大小介于 250bp~750bp 之间，且 500bp左右的克隆最多，结果如图 2.2 所示。筛选次数1 2 3 4投入量(pfu)3×1083×1083×1083×108产出量(pfu)2×1044.2×1041.9×1055×105投入/产出 0.67×10-41.4×10-46.3×10-41.7×10-3

图 3.1 ELISA 检测噬菌体与 rMgPa 的特异结合Fig 3.1 The specific combination between representative phages and rMgPa were detecELISA .Note: P1-P7: number of representative phages; WT: Wild type phage. BSA was used as blank control. The indicates p<0.01 compared with the BSAgroup, * indicatep<0.05 compared with the BSAgroup.4.3.2 斑点免疫印迹检测阳性噬菌体与 rMgPa 的特异结合采用斑点免疫印迹法进一步检测 7 个代表性噬菌体能否与 rMgPa 特异结结果如图 3.2 所示：P1、P2 和 P3 代表性噬菌体出现了明显的斑点，说明 P（RPL-35）、P2（Mitochondrio complete genome）和 P3（RPN4）能与 rM特异结合，该结果与上述 ELISA 的结果一致。
【参考文献】

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1 朱有葱;何军;游晓星;朱翠明;李冉辉;曾焱华;;人尿道上皮细胞T7噬菌体展示cDNA文库的构建与鉴定[J];生物技术;2015年02期

2 曾焱华;邓仲良;余坚;朱翠明;余敏君;张红;;生殖支原体黏附素蛋白模拟表位的筛选和鉴定[J];实用预防医学;2012年12期

3 曾焱华;吴移谋;游晓星;詹利生;粟盛梅;邓红玉;;生殖支原体粘附素蛋白MgPa的表达及其多克隆抗体的制备与纯化[J];中国免疫学杂志;2010年11期

4 曾焱华;吴移谋;余敏君;刘劼;游晓星;唐双阳;;穿透支原体LAMPs诱导NF-κB激活介导小鼠巨噬细胞凋亡[J];微生物学报;2008年03期

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本文编号：2861719