单增李斯特菌nox基因的克

发布时间：2020-10-30 05:16

　　 以Gen Bank中报道的单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)野生型菌株EGDe的nox基因(Gen Bank ID:986631)为研究对象,探讨在高等动植物中普遍存在的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶在Lm中是否也可以介导产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)。首先通过诱导nox基因在BL21中表达产生Nox蛋白,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot鉴定该蛋白质分子质量;然后构建过表达菌株EGDe-nox,测定ROS产生情况,并使用实时荧光定量-聚合酶链式反应检测nox基因的过表达对Lm毒力基因表达的影响。结果表明,经鉴定Nox蛋白分子质量约为33 k D,过表达菌株EGDe-nox与对照组EGDe的ROS产生量相比并无多大变化,nox基因的过表达会导致与侵袭相关的基因act A、inlA和inlB以及毒力基因prfA的表达上调。由此推测,该Nox蛋白不能独立主导ROS的产量,但其过表达却可以增强毒力基因表达上调。本研究为继续探讨细菌中Nox的作用提供一定的参考依据。
【部分图文】：

?mL重悬菌液，静置于37℃培养箱中培养3h后添加1mL苯酚-乙醇（1∶9，V/V）4℃低温混合液，冰上孵育30min。将样品5000×g离心5min，收集沉淀菌体。将沉淀菌体用裂解液（包含50μL250U/mL的变溶菌素和50μL25mg/mL的溶菌酶）进行重悬，超声溶解30min。采用Trizol法提取裂解液中的RNA。采用PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit将RNA反转录成cDNA，以制得的cDNA作为模板进行qRT-PCR实验。2结果与分析2.1nox基因的克隆与表达2.1.1EGDe中nox基因的鉴定结果700bp500bp400bpM12MM.DNAMarker；1、2.EGDe。图1PCR鉴定EGDe中的nox基因结果Fig.1DetectionofnoxfromEGDebyPCR利用引物nox-F和nox-R对EGDe进行nox基因的扩增，结果如图1所示，泳道1、2为EGDe的nox基因的扩增产物，从图中可看到在633bp处皆有目的条带出现，说明在EGDe中有nox基因序列存在。

※生物工程食品科学2017,Vol.38,No.02492.1.2重组载体T-nox的构建结果鉴定700bp500bp400bpMA12345700bp500bp400bpMB6789M.DNAMarker；1～5.阳性克隆；6～9.双酶切结果。图2重组载体T-nox的PCR（A）及双酶切（B）鉴定结果Fig.2DetectionofrecombinantvectorT-noxbyPCR(A)andidentificationbydoublerestrictionenzymedigestion(B)利用引物nox-F和nox-R对阳性克隆进行PCR鉴定，结果如图2A所示，得到如预期大小（633bp）的PCR产物；图2B显示的是用XhoⅠ和SalⅠ双酶切之后的结果，上面的条带是T载体，下面的条带则是嵌合的基因nox。这两种鉴定结果证明nox基因已正确和T载体连接，测序结果正确率达到99%以上，进一步证明连接正确。2.1.3重组载体pET30a-nox构建结果鉴定500bpMA12345678910700bp500bp1000bp5000bp11MB1213M.DNAMarker；1～10.单菌落；11～12.对A图的阳性克隆进行双酶切鉴定；13.pET30a质粒。图3重组质粒pET30a-nox的PCR（A）和双酶切（B）鉴定结果Fig.3DetectionofrecombinantplasmidpET30a-noxbyPCR(A)andidentificationbydoublerestrictionenzymedigestion(B)重组质粒pET30a-nox鉴定结果如图3A、B所示，A图是用引物nox-F和nox-R对10个单克隆进行PCR鉴定，泳道2、4、8在633bp处出现目的条带，说明这3个单克隆为阳性克隆；对阳性克隆进行XhoⅠ和SalⅠ双酶切鉴定，结果如图B泳道11～22，在5000bp上一点各有一条带为酶切后的pET30a质粒条带，原pET30a大小为5422bp，而在633bp处也各有一条带，为酶切后的nox基因片段。重组质粒pET30a-nox测序结果正确率99%以上，证明该质粒构建成功。2.1.4pET30a-nox表达产物SDS-PAGE分析M1234kD26kD17kD33kD25kDM.蛋白质分子质量?

nenzymedigestion(B)利用引物nox-F和nox-R对阳性克隆进行PCR鉴定，结果如图2A所示，得到如预期大小（633bp）的PCR产物；图2B显示的是用XhoⅠ和SalⅠ双酶切之后的结果，上面的条带是T载体，下面的条带则是嵌合的基因nox。这两种鉴定结果证明nox基因已正确和T载体连接，测序结果正确率达到99%以上，进一步证明连接正确。2.1.3重组载体pET30a-nox构建结果鉴定500bpMA12345678910700bp500bp1000bp5000bp11MB1213M.DNAMarker；1～10.单菌落；11～12.对A图的阳性克隆进行双酶切鉴定；13.pET30a质粒。图3重组质粒pET30a-nox的PCR（A）和双酶切（B）鉴定结果Fig.3DetectionofrecombinantplasmidpET30a-noxbyPCR(A)andidentificationbydoublerestrictionenzymedigestion(B)重组质粒pET30a-nox鉴定结果如图3A、B所示，A图是用引物nox-F和nox-R对10个单克隆进行PCR鉴定，泳道2、4、8在633bp处出现目的条带，说明这3个单克隆为阳性克隆；对阳性克隆进行XhoⅠ和SalⅠ双酶切鉴定，结果如图B泳道11～22，在5000bp上一点各有一条带为酶切后的pET30a质粒条带，原pET30a大小为5422bp，而在633bp处也各有一条带，为酶切后的nox基因片段。重组质粒pET30a-nox测序结果正确率99%以上，证明该质粒构建成功。2.1.4pET30a-nox表达产物SDS-PAGE分析M1234kD26kD17kD33kD25kDM.蛋白质分子质量标准；1.未诱导组；2.诱导组。图4pET30a-nox表达产物SDS-PAGE分析Fig.4SDS-PAGEanalysisofexpressionproductsofpET30a-nox将重组的pET30a-nox转入表达型大肠杆菌BL21诱导表达，经过蛋白电泳并染色脱色后的条带结果如图4所示。对诱导前泳道和诱导后泳道的对比发现，在25kD和33kD处的蛋白条带均在诱导后出现了表达升高。泳道1为未诱
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