IL-27及IFN-γ对hPMSCs诱导不同调节性T细胞亚群形成的作用研究

发布时间：2020-11-03 20:29

　　 目的:研究人胎盘源间充质干细胞(human placenta derived mesenchymal stem cells,hPMSCs)对人源化移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)小鼠模型体内CD4+IL-10+IFN-y+T细胞亚群转化及血清中IL-27、IFN-γ和IL-10水平的影响;探讨IL-27对hPMSCs诱导CD4+IL-10+IFN-γ+T细胞亚群转化的作用及机制;分析IFN-γ对hPMSCs的黏附、增殖、迁移以及其对不同调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)亚群调节作用的影响。方法:1.采用6-8周龄的非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)构建人源化GVHD模型,随后用hPMSCs干预治疗。分别于治疗后第7、14天将小鼠处死取材。2.流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析脾脏、肝脏中CD4+IL-10+IFN-γ+T细胞亚群比例变化。3.ELISA法检测血清中IL-27、IFN-γ及IL-10水平。4.苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法观察肺脏、肾脏的组织形态学改变。5.体外应用FCM检测①IL-27受体(IL-27receptor,IL-27R)在hPMSCs上的表达,②IL-27对hPMSCs诱导CD4+IL-10+IFN-γ+T细胞亚群形成的调节作用,③IFN-γ对hPMSCs诱导CD4+CXCR5+Foxp3+等Treg亚群转化的调节作用。6.IL-27对hPMSCs上程序性死亡配体2(programmed death ligand 2,PDL2)的调节作用及其信号通路通过FCM及Westen blot分析。7.实时细胞分析(real-time cell analysis,RTCA)仪实时动态检测 IFN-y 对 hPMSCs 黏附、增殖和迁移的调节作用。结果:1..hPMSCs可诱导CD4+IL-10+IFN-γ+T细胞亚群的形成,并改善人源化GVHD小鼠的临床症状(1)hPMSCs与植物血凝素(PHA)活化的健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)共培养后,CD4+IL-10+IFN-γT 细胞亚群在PBMC中的比例明显高于PHA单独活化PBMC组。(2)成功构建人源化GVHD小鼠模型。(3)FCM结果表明,与PBS对照组相比,hPMSCs干预后,小鼠肝脏中CD4+IL-10+IFN-γ+T细胞亚群升高比例明显高于脾脏(P0.01)。(4)细胞因子分析结果显示,与PBS对照组相比,hPMSCs治疗7天后IL-10水平明显提高(P0.01),而IL-27、IFN-γ水平明显降低(P0.01);且hPMSCs治疗14天后细胞因子改变更加显著。(5)HE染色结果显示,与PBS对照组相比,hPMSCs干预后小鼠肺脏、肾脏的形态学改变明显减轻。(6)相比于PBS组,GVHD小鼠经hPMSCs干预后体重明显增加(P0.001),行为学评分显著降低(P0.001),生存期明显延长(P0.001)。2.IL-27可促进hPMSCs诱导CD4+IL-10+IFN-γ+T细胞亚群的形成(1)FCM结果表明hPMSCs表达IL-27R。(2)相比于未处理组,经IL-27预处理hPMSCs后,CD4+IL-10+IFN-γ+T细胞亚群在PBMC中的比例明显升高。(3)IL-27可通过JAK/STAT信号通路上调PDL2在hPMSCs上的表达。3.IFN-y可调节hPMSCs的黏附、增殖、迁移,促进hPMSCs诱导不同的Treg亚群形成(1)hPMSCs增殖及迁移的细胞指数分别于与IFN-y(10 ng/ml,20 ng/ml,30 ng/ml)共培养64 h及20 h后下降。而IFN-γ与hPMSCs共培养对其黏附的细胞指数无影响。(2)hPMSCs可上调CD4+CXCR5+Foxp3+T细胞亚群在PBMC中百分比,且经IFN-γ干预后,此亚群的比例可进一步升高。(3)hPMSCs经IFN-γ干预后再与活化的PBMC共培养后,CD4+CXCR5+Foxp3+T细胞亚群的百分比增长倍数明显高于 CD4+CD25+Foxp3+,CD8+CD25+Foxp3+,CD4+IL-10+和CD8+IL-10+T细胞亚群。结论:1.hPMSCs可通过诱导CD4+IL-10+IFN-γ+T细胞亚群,平衡血清中IL-27、IFN-y和IL-10水平,进而减轻GVHD小鼠的临床症状。2.IL-27可通过JAK/STAT通路上调PDL2在hPMSCs上的表达,进而增强hPMSCs对CD4+IL-10+IFN-γ+T细胞亚群的诱导形成作用。3.IFN-y可抑制hPMSCs的增殖以及迁移,且IFN-y可提高hPMSCs诱导活化的PBMC向不同的Treg亚群转化的作用。IFN-y预处理hPMSCs后,相比于CD4+CD25+Foxp3+,CD8+CD25+Foxp3+,CD4+IL-10+和 CD8+IL-10+T 细胞亚群,hPMSCs对CD4+CXCR5+Foxp3+T细胞亚群的诱导形成能力最强。
【学位单位】：滨州医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392
【部分图文】：

成功构建模型后，ｈＰＭＳＣｓ经尾静脉输注用于治疗，同时使用ＰＢＳ干预??作为对照。分别于ＧＶＨＤ小鼠到达发病标准及ｈＰＭＳＣｓ分别治疗７和１４天后将??小鼠处死后，取小鼠的脾脏、肝脏、肾脏、肺脏及血清，进行相应的实验（图１??Ｂ）。??Ａ?Ｂ??Ｃｏｕｄｉｔｉｏｕｍｇ?ｒｅｇｕｕｅｕ?Ｌ?ｄ？ｙ?１８??ｍ＜?ａＡＳＧＭ．?，ＰＢＳｄ＞ｙ＂?＞?＿??？＿，?２｜?卜３?叫?乂?＾?—??ＮＯＤ／ＳＣＩＤ?Ｔｒａｍｆｕｓｉｏｕ?Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ?ＧＶＨＩ＞＊＾?ｄａｙ?１８??１??ｈＰＭＳＣｓ?ｄａｙ?１１??ｄ？ｙ２５??图１－１小鼠分组、人源化ＧＶＨＤ小鼠诱导和ｈＰＭＳＣｓ干预流程。（Ａ）ＮＯＤ／ＳＣｌＤ小??鼠在第１、２天腹腔注射ＣＴＸ，第３天注射ＮＫ细胞抑制剂。（Ｂ）尾静脉注射ＰＢＭＣ诱导??人源化ＧＶＨＤ模型。注射ＰＢＭＣＩ１天后，模型诱导成功，分别使用ＰＢＳ和ｈＰＭＳＣｓ经尾静??脉输注进行干预。分别于干预７天及１４天后，处死小鼠取材。??Ｆｉｇｕｒｅ?１－?１?Ｇｒｏｕｐ?ｄｉｖｉｓｉｏｎ?ａｎｄ?ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ?ｆｏｒ?ｘｅｎｏ－ＧＶＨＤ?ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．?（Ａ）?ＮＯＤ／ＳＣＩＤ?ｍｉｃｅ??ｒｅｃｅｉｖｅｄ?ＣＴＸ?ｆｏｒ?ｄａｙｓ?１?ｔｏ?２?ａｎｄ?ａｎｔｉ－ａＡＳＧＭｌ?ｆｏｒ?ｄａｙ?３．?（Ｂ）?ＰＢＭＣ?ｗｅｒｅ?ｉｎｊｅｃｔｅｄ?ｔｏ?ｍｉｃｅ?ｔｏ??ｂｕｉｌｄ?ｔｈｅ?ｘｅｎｏ－ＧＶＨＤ?ｍｏｄｅｌ．?Ａｆｔｅｒ?１１?ｄａｙｓ

２、ｈＰＭＳＣｓ对ＣＩ）４＋ＩＬ－１０＋ＩＦＮ－ｙ＋Ｔ细胞的体内外调节作用??体外实验结果显示，ｈＰＭＳＣｓ与活化ＰＢＭＣ共培养后，ＣＤ４＋ＩＬ－１０＋ＩＦＮ－Ｙ＋Ｔ??细胞在ＰＢＭＣ中的百分比显著升高相比于活化ＰＢＭＣ组（ｐ＜０．０１，图１－４Ａ，Ｂ）。??ＰＢＭＣ通过尾静脉成功诱导人源化ＧＶＨＤ模型后，使用ｈＰＭＳＣｓ治疗７天??后，发现与ＰＢＳ组相比，ＣＤ４＋ＩＬ－１０＋ＩＦＮ－Ｙ＋Ｔ细胞的在脾脏及肝脏中的比例明显??２５??

?ＰＢＭＣ?ＧＶＨＤ＾?Ｄａｙ?７?Ｄａｙ?１４?、、＾５?＾?＾?必、？??…、气ｖ？：ｙ??图１－４?１＾１＾＃刀冤柀枺矗?福?保埃??啵保埽保?荆?∠赴?奶迥谕獾鹘谧饔谩＃保壁啵保蓿福３与活化卩８！＼４＃崳?共培养后，ＣＤ４＋ＩＬ－１０＋ＩＦＮ－ｙ＋Ｔ细胞亚群在ＰＢＭＣ中百分比的流式代表图（Ａ）及百分数（Ｂ）。??不同组别小鼠脾脏（Ｃ）及肝脏（Ｄ）中ＣＤ４＋ＩＬ－１０＋１ＦＮ－ｙ＋Ｔ细胞亚群的流式代表图。不同??组别小鼠脾脏（Ｅ）和肝脏（Ｆ）中ＣＤ４＋ＩＬ－１０＋ＩＦＮ－ｙ＋Ｔ细胞亚群的的百分数。（Ｇ）不同组??别小鼠脾脏及肝脏中ＣＤ４＋ＩＬ－１０＋ＩＦＮ－Ｙ＋Ｔ细胞亚群的百分数的比较。（＊ｐ＜０．０５
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本文编号：2869063