登革病毒(Dengue virus,DENV)是一种重要的蚊媒传染病病毒。登革病毒主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊的叮咬在人群中扩散,引起的临床症状轻重不一,从温和的登革热(Dengue fever,DF)到严重的登革出血热(Dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革休克综合征(Dengue shock syndrome,DSS),其中以登革热病例最常见。全球128个国家有25亿人面临登革病毒感染的风险,每年感染者中大约有50万人需要住院治疗,病死率在2.5%左右。热带和亚热带地区是登革病毒感染流行的主要区域,我国南部的广东、海南和云南都属于疫区,几乎每年都有登革病毒感染病例,其中2014年我国广东省爆发登革热疫情,感染病例达到46864人,其中6人死亡,造成严重的公共卫生安全问题。目前针对登革病毒感染的防治药物匮乏。赛诺菲-巴斯德公司研制的四价减毒活疫苗Dengvaxia从2015年底开始在墨西哥、菲律宾和巴西等三个国家获得批准使用,但是由于保护效果不理想且可能会对登革病毒血清抗体反应为阴性的人群造成更严重的后果,2017年底菲律宾卫生当局已经要求停止接种该疫苗。此外,目前市场上还没有登革病毒感染的特效治疗药物,临床上主要以对症治疗为主。因此,需要开发更有效的对抗登革病毒感染的防治手段。针对埃博拉、呼吸道合胞病毒感染的临床实践已经证明中和抗体是一种有效的应对病毒感染的治疗方法,研究表明抗登革病毒的中和抗体也可以快速有效地中和小鼠体内的登革病毒,达到抑制病毒增殖的目的,所以利用抗登革病毒中和抗体治疗登革病毒感染,应该是一种理想而有效的抗登革感染治疗策略。基于单细胞PCR的抗体筛选制备方案是最近几年发展起来的一种全人源的抗体制备技术,其基本原理是采集患者或者疫苗免疫人群的外周血并分离单个B细胞,PCR扩增单个细胞的抗体基因,进行表达和筛选。该技术可以快速获得全人源抗体,而且所获得的抗体经过了体内亲和力成熟,具有非常大的优势。为了快速获取抗登革病毒的抗体,本研究采用单B细胞抗体制备技术,利用从恢复期登革热患者外周血中分选得到的抗体分泌细胞扩增抗体基因,开展了针对登革病毒的中和抗体的研制工作。本研究首先从3例恢复期登革热患者采集了30mL外周血,利用密度梯度沉降法,分离淋巴细胞,然后根据B细胞表面分子标记对分离获得的淋巴细胞进行荧光标记,流式细胞术分选CD19~(high)/CD20~(low to negative)/CD3~(negative)/CD27~(high)/CD38~(high)的单B细胞,共计1056个。通过反转录PCR和巢式PCR两步从单B细胞中扩增抗体基因,最终获得了496个H链,707个κ链,222个λ链可变区基因片段,经分析发现轻重链配对的共有285对,占初始细胞总数的27%左右,其中轻链为?的有223对,轻链为λ的有62对。随后将扩增获得的基因插入表达载体构建真核表达质粒,转染FreeStyle~TMM HEK293-F细胞进行抗体表达,成功表达261株抗体。以灭活的四种血清型的登革病毒等量混合作为抗原,通过ELISA筛选获得88株可以特异结合灭活的登革病毒的抗体,阳性率为33.7%。进一步的体外中和活性评价显示有24株抗体在浓度为10μg/m L时可以中和50%以上的DENV-1,其中1G5、3A6、6B1和9C7的中和活性最好,1G5和9C7的抑制率达到100%,3A6和6B1也都在95%以上。根据抗体对DENV-1体外中和活性评价的结果,我们选取中和活性最好的四株抗体进行了亲和力、交叉保护效果及体内外活性评价。以灭活病毒为抗原,利用ELISA评价抗体的亲和力,结果显示1G5对DENV-1的亲和力较高,基本不与其他三种血清型病毒结合,3A6、6B1和9C7则均可结合四种血清型登革病毒,只是9C7对DENV-4的亲和力较低,6B1对DENV-3和DENV-4的亲和力较低。随后我们利用蛋白免疫印迹初步分析四株抗体所识别的病毒抗原,结果显示其中三株抗体(1G5、6B1和9C7)识别登革病毒的E蛋白,而3A6识别登革病毒的prM蛋白。另外,1G5和9C7均不结合原核表达的重组E蛋白,推测这两株抗体识别的抗原表位可能是空间表位,也可能是具有糖基化等修饰的表位;6B1既可以识别病毒的E蛋白,又可以识别重组E蛋白,推断6B1结合的位点可能是E蛋白上的线性表位。体外中和实验结果显示1G5针对DENV-1有非常好的保护效果,与其他三种血清型的病毒没有交叉保护效果;9C7、3A6和6B1可以同时中和四种血清型的病毒,但是9C7的中和活性比3A6和6B1高10倍以上,因此我们选择1G5和9C7进行了体内抗病毒活性评价。研究结果发现1G5可有效预防和治疗致死剂量的DENV-1对乳鼠的攻击。9C7可有效预防和治疗致死剂量的四种血清型登革病毒对乳鼠的攻击。登革病毒抗体引起的抗体依赖的感染增强作用(antibody dependent enhancment,ADE)是限制其临床应用的重要因素,我们利用K562细胞作为感染模型检测抗体依赖的感染增强效果,结果显示:1G5和9C7在亚中和浓度时,均可增强登革病毒的感染,产生ADE作用。为了降低这两株候选抗体的ADE活性,我们分别在其Fc段引入突变,检测结果显示改构后的抗体分子在亚中和浓度时对登革病毒的感染增强作用均显著降低或消除。Ⅰ型和Ⅱ型干扰素受体基因缺失(Ifnar1~(-/-)Ifngr1~(-/-))的免疫缺陷模型小鼠是登革病毒感染和评价抗体体内抗病毒活性的首选模型动物。我们利用CRISPR-Cas9技术成功构建Ifnar1~(-/-)Ifngr1~(-/-)的免疫缺陷模型小鼠,为抗登革病毒中和抗体研制工作的进一步顺利开展奠定了基础。综上所述,本研究建立了从单个B细胞制备抗体的方法,可以从感染患者或疫苗免疫人群的外周血中快速高效的制备中和抗体,研究筛选到2株具有良好的体内外中和活性的抗登革病毒全人源单克隆抗体,抗体经过改造后,已检测不到明显的ADE作用,经过进一步的评价和优化,具有开发为治疗登革病毒感染的被动免疫制剂的潜力。
【学位单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392
【部分图文】：
图 1 DENV 基因组 RNA 所编码的 10 个蛋白质[8]DENV 的基因组是 11Kb 的单股正链 RNA，编码 3 个结构蛋白（包膜蛋白 E、前体蛋白 prM 和衣壳蛋白 C）和 7 个非结构蛋白（NS）[9]，如图 1 所示。位于毒颗粒内部的C蛋白富含赖氨酸和精氨酸，与基因组RNA结合而发挥保护作用。毒颗粒表面展示的是 prM 蛋白和 E 蛋白，这两种糖蛋白均是 DENV 重要的保护
图 2 DENV E 蛋白结构及其在成熟病毒颗粒上的排列[18]注： A：成熟病毒颗粒表面 E 蛋白的结构，6 个 E蛋白排列形成 3 个二聚体结构，绿色标的是融合肽；B：E 蛋白由胞外区、两个亲性螺旋和保守的茎区以及两个跨膜螺旋组成，红、黄、蓝依次代表胞外区的结构域 I、结构域 II 和结构域 III。在病毒的感染过程中，DENV 首先附着于宿主细胞膜表面，并通过受体介导
图 3 DENV的生命周期[8, 18]V 病毒颗粒结合特定的受体并通过网格蛋白介导的内吞作用进入宿主细宿主细胞膜在低 pH 的情况下融合，将病毒 RNA 释放到宿主细胞质中和翻译，病毒颗粒在 ER 中进行组装，在 TGN 中进行翻译后修饰和加粒被胞吐释放。在 DENV 生命周期的不同阶段，病毒颗粒存在三种重）不成熟病毒颗粒，2）成熟病毒颗粒和 3）融合后构象。B）prM 蛋白
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本文编号：
2871195
