改良SDS法提取书虱总RNA的效果评估

发布时间：2020-11-08 13:27

　　 目的建立有效的提取书虱总RNA的方法。方法分别采取改良SDS法、传统SDS法和TRIzol法提取书虱总RNA;采用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性;核酸蛋白分析仪测定RNA纯度和浓度,纯度以A_(260)/A_(280)、A_(260)/A_(230)表示,通过浓度推算产率;以β-actin为目的基因,RT-PCR法初步评价RNA提取效果。同时,用改良SDS法探究不同数量的书虱总RNA提取效果。结果改良SDS法产率最高。经方差分析,3种方法的浓度差异具有统计学意义(F=17.874,P0.001),经SNK法每组互比,改良SDS法浓度较高,其次为TRIzol法,传统SDS法较低。TRIzol法未见28s条带;传统SDS法有gDNA污染;而改良SDS法电泳结果显示28s、18s条带完整清晰,条带之间无明显弥散现象,说明提取的RNA完整性较高。3种方法提取的RNA经RT-PCR均能扩增出阳性条带。30只书虱即可获得高质量RNA,满足后续实验要求。结论改良SDS法操作简单、成本低、耗时少,适于书虱总RNA的提取。
【部分图文】：

改良SDS法、传统SDS法、TRIzol法提取书虱总RNA的浓度值差异有统计学意义(F=17.874,P<0.001)。经SNK法每组互比,改良SDS法浓度较高,其次为TRIzol法,传统SDS法较低(表1)。改良SDS法及传统SDS法提取RNA的A260/A280均在理想值范围1.8～2.0内,说明存在蛋白质污染;TRIzol法的A260/A280高于2.0。改良SDS法提取RNA 的A260/A230在理想值范围2.0～2.2内,说明该方法可去除脂类、多糖等成分。TRIzol 法的A260/A230低于2.0,说明存在有机物质等污染。

表2 不同pH值的KAc缓冲液提取的书虱总RNA浓度和纯度 pH 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 浓度(μg/μL) 0.51 0.62 0.57 1.10 1.36 1.31 1.04 A260/A280 1.95 1.94 1.99 1.98 1.98 1.96 1.97 A260/A230 2.12 2.25 2.16 2.14 2.18 2.21 2.19三、改良SDS法书虱最低适宜数量

表3 不同书虱数量提取的总RNA浓度和纯度 数量 1 10 20 30 50 100 浓度(μg/μL) 0 0.08 0.19 0.38 0.62 0.77 A260/A280 0 1.89 1.92 1.98 1.98 1.95 A260/A230 0 2.01 2.06 2.10 2.16 2.13四、 RT-PCR扩增β-actin基因
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