甘露聚糖结合凝集素对Th17细胞诱导分化的影响

发布时间：2020-11-10 04:30

　　 背景甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin,MBL)是天然免疫系统中一个关键的可溶性模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR),在天然免疫系统中扮演至关重要的作用。辅助性T细胞17(T help cell17,Th17)是一类分泌IL-17细胞因子(IL-17是Th17细胞特异性的细胞因子)的CD4~+T细胞亚群。与MBL同为C型凝集素家族的dectin-1能够促进Th17细胞的分化。那么MBL与Th17细胞之间又有什么关系呢?是否能够调节Th17细胞的分化呢?至今仍然不得而知。因此,深入研究MBL对Th17细胞诱导分化的影响,对阐明MBL在获得性免疫方面的新角色,具有重要意义。目的探讨MBL对Th17细胞诱导分化的影响,为Th17细胞相关的自身免疫性疾病和炎性疾病的治疗提供新思路。方法1.Ficoll密度梯度离心:采用Ficoll密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞(Cord blood mononuclear cells,CBMCs)。2.免疫磁珠分选:采用免疫磁珠分选法,从上述获得的CBMCs中分选出CD4~+T细胞。3.流式细胞术(FACS)检测:对照组用anti-CD3 McAb和anti-CD28 McAb活化CD4~+T细胞并加入适当浓度的IL-6和TGF-β1作为诱导剂,在对照组的基础上加入不同浓度(1μg/mL、5μg/mL及10μg/mL)的MBL作为实验组。各组细胞培养72h后,利用FACS检测各组中CD4~+RORγt~+T细胞(即Th17细胞)的比例变化情况。4.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析:采用qRT-PCR技术分别检测对照组和不同浓度MBL实验组中Th17细胞核转录因子维甲酸孤儿受体-γt(Retinoid-related orphan receptor-γ-t,RORγt)mRNA表达水平。5.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测:采用ELISA法检测各组细胞上清液中IL-17A的含量。6.MBL基因敲除小鼠鉴定:采用基因分型及基因测序等技术分别鉴定小鼠MBL-A基因敲除(MBL-A~(-/-))、MBL-C基因敲除(MBL-C~(-/-))、MBL-A基因和MBL-C基因双敲除(即MBL~(-/-))情况。7.FACS检测:采用FACS分别检测MBL~(-/-)小鼠和WT小鼠的Th17细胞数量变化。8.统计学分析:所有数据均运用SPSS22.0软件进行统计学分析,实验数据均以xˉ±s表示,数据采用单因素方差分析法(one-way ANOVA)以及独立样本t检验,P0.05为差异具有统计学意义(*P0.05,**P0.01)。结果1.MBL能够显著降低CD4~+RORγt~+Th17细胞的比例:FACS检测结果显示,与对照组相比,5μg/mL MBL组及10μg/mL MBL组的CD4~+RORγt~+Th17细胞比例显著降低。2.MBL能够显著降低RORγt mRNA的表达:qRT-PCR结果显示,与对照组相比,5μg/mL MBL组及10μg/mL MBL组的RORγt mRNA的表达量显著降低。3.MBL能够显著降低IL-17A的表达水平:ELISA检测结果表明,与对照组相比,5μg/mL MBL组及10μg/mL MBL组的IL-17A分泌水平显著降低。4.获得MBL基因敲除小鼠:基因分型及基因测序结果显示,成功获得MBL-A基因敲除(MBL-A~(-/-))、MBL-C基因敲除(MBL-C~(-/-))、MBL-A基因和MBL-C基因双敲除(MBL~(-/-))等3个品系的MBL基因敲除小鼠。5.MBL基因敲除后Th17细胞比例显著上升:FACS检测结果显示,与WT小鼠相比,MBL~(-/-)小鼠CD4~+RORγt~+Th17细胞比例显著上升。结论MBL能够抑制CD4~+T细胞向Th17细胞诱导分化。
【学位单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392
【部分图文】：

1 免疫磁珠分选出的 CD4+T 细胞经 FACS 检测he percentage of CD4+T cells purified by MACS s4+T 细胞向 Th17 细胞诱导分化： anti-CD28mAb 处理的 CD4+T 细胞，同时加入的基础上加入不同浓度的 MBL 作为实验组，为（6.31±0.90）%（图 2A）；1μg/mL MBL 组为（±0.83）%（图 2C）；10μg/mL MBL 组为（3.05±0对照组相比差异无统计学意义（P﹥0.05）；5μg/m﹤0.01）；10μg/mL MBL 组与对照组相比差异具BL 能够抑制 Th17 细胞的诱导分化。

33图 2 各组细胞诱导后 CD4+RORγt+T 细胞的比例变化Fig 2 The percentages of CD4+RORγt+T cells in different groups after induction in vitro注：A：未加 MBL 组；B：1μg/mL MBL 组；C：5μg/mL MBL 组；D：10μg/mL MBL 组；E：统计分析 。1：未加 MBL 组；2：1μg/mL MBL 组；3：5μg/mL MBL 组；4：10μg/mL MBL 组3.3 MBL 抑制 Th17 细胞 RORγt mRNA 的表达：分别检测未加 MBL 对照组以及加入不同浓度的 MBL 组：1μg/mL MBL 组，5μg/mL MBL 组，10μg/mL MBL 组。qRT-PCR 结果显示，未加 MBL 组中 RORγt mRNA

相对定量为 1.00±0.17；1μg/mL MBL 组中 RORγt mRNA 的表达9；5μg/mL MBL 组中 RORγt mRNA 的表达量为 0.54±0.11；10μg/mL MBγt mRNA 的表达量为 0.27±0.07。1μg/mL MBL 组与对照组相比差异无统﹥0.05）；5μg/mL MBL 组与对照组相比差异具有统计学意义（P﹤0.0 MBL 组与对照组相比差异具有统计学意义（P﹤0.01，图 3C）。结果提够抑制 Th17 细胞 RORγt mRNA 的表达。
【参考文献】

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本文编号：2877478