志贺菌分为4个群,其中福氏志贺菌(Shigella flexneri, S. flexneri)是发展中国家引起细菌性腹泻的主要病原菌。根据O-抗原的不同,福氏志贺菌至少可以分为19种血清型。O-抗原上四糖骨架中特定糖的糖基化或/和乙酰化、以及磷酸乙醇胺(Phophoethanolamine, PEtN)修饰形成了其血清型的多样性。这种O-抗原的修饰是由血清型转换噬菌体和质粒所介导的。糖基化和乙酰化修饰是由血清型转换噬菌体所介导的；而磷酸乙醇胺修饰是由质粒携带的opt基因将PEtN基团连接到四糖骨架上2号或3号位的鼠李糖(RhaⅡ, RhaⅢ)上完成的。我们实验室发现有两种opt基因,分别是pSFXv_2质粒携带的optll和pSFyv_2质粒携带的optⅢ。optⅡ优先修饰RhaⅡ形成Xv血清型,optⅢ优先修饰RhaⅢ形成Yv和4av血清型。 新的血清型Xv于2000年首先在河南出现,随后其分离率逐渐升高,于2002—2006年间取代2a血清型成为河南省的优势血清型。Xv血清型在中国的甘肃省、安徽省以及其他省份也相继出现,并一度成为当地的优势血清型。我们以前的研究发现,我国分离的Xv血清型菌株为序列型91(sequence type, ST91). ST91也是我国福氏志贺菌的优势序列型。通过对我国分离的Xv血清型菌株2002017(ST91)测序发现,它的基因组含有血清型转换噬菌体SfX,并通过pSFXv_2质粒携带的opt基因对O-抗原进行PEtN修饰,转换为新的Xv血清型。通过测序还发现,它获得了志贺菌耐药岛(Shigella resistance locus, SRL)和Tn7耐药岛。SRL和Tn7岛携带多种耐药基因。与首次发现并命名SRL岛的日本菌株YSH6000相比,我国分离的福氏志贺菌2002017的SRL岛有两个特征,一是在SRL岛上额外插入了1个编码四环素耐药蛋白的tet基因簇,所以在2002017上有2个与四环素耐药相关的基因簇；二是没有YSH6000上编码转铁系统(ferric transport system)的fec基因簇。2002017的Tn7岛序列与2457T(血清型2a,ST86)、Sf301(2a, ST18)、Sf8401(5b, ST93)和YSH6000(2a)菌株的相同,序列较为保守。 目前对福氏志贺菌优势克隆群的基因组进化及选择压力,新血清型在我国的流行、传播特征均不清楚。另外国内外也缺乏福氏志贺菌的全基因组信息,尚未建立起其进化关系。为了揭示我国福氏志贺菌这方面的基因组特征,本研究对14种血清型的59株福氏志贺菌(包括Xv[25株],X[9株],1a[7株],1b[1株],1d[1株],2a[5株],2b[1株],3a[3株],3b[1株],4a[1株],4av[1株],4b[1株],Y[2株]和Yv[1株]),7个序列型(包括ST91[50株],ST109[1株],ST18[3株],ST142[1株],ST143[1株],ST103[2株],ST16[1株])进行了全基因组测序。并与已经公布序列的5株福氏志贺菌(2002017,Sf301,2457T,Sf8401和M90T)的基因组序列一起进行分析。通过扫描64株菌基因组上的耐药岛及耐药基因后发现,ST91序列型自20世纪90年代初期(1993年)开始出现,通过获得SRL和Tn7两个多重耐药岛以及喹诺酮类药物的耐药基因gyrA上2个非同义突变,最终成为我国的优势克隆群。基于核心基因(core genome)上的1,790个高质量单核苷酸位点(single-nucleotide polymorphism, SNP)构建的BEAST进化树显示,Xv血清型菌株形成了各自独立起源且分化时间不同的3个基因组群(genome cluster)。其中,群1是河南省的优势群,分化时间最早,为1999年,并在其他两个省份广泛传播。随后群3(安徽省的优势群)和群2(甘肃省的优势群)相隔1年相继分化。提示Xv血清型的3个群具有多地起源和地域性的特征。 我们通过对59株菌的opt基因序列分析发现,所有25株Xv血清型菌株均携带optⅡ基因,1株Yv血清型菌株携带optⅢ基因,3株X血清型菌株携带失活的optⅡ基因,其他菌株均未携带opt基因。与2002017携带的optⅡ相比,25株Xv菌株携带的optⅡ基因序列存在3种变化,有1个或2个碱基的差异。Yv血清型菌株携带的optⅢ基因与HN006菌株携带的optⅢ序列相差1个碱基。3株X血清型菌株虽然也携带optⅡ基因,但均有1个碱基的缺失,形成了终止密码子,导致了optⅡ基因的失活。所有25株Xv菌株和3株X菌株均携带pSFXv_2质粒,而其他菌株均未检测到这个质粒。群1和群2的pSFXv_2序列高度同源,而群3的质粒序列与其他两个群相差15个SNP。我们通过比较Xv血清型3个群菌株的染色体、pSFXv_2质粒及opt基因的SNP发现,染色体和pSFXv_2质粒上的变化具有一致性,说明质粒和染色体具有共进化的特征。而且群1和群2的基因组序列高度同源,可能具有共同起源,而群3是独立起源的。 接下来为了验证Xv血清型3个群的地域性特征,我们挑选18个群特异性(cluster-specific) SNP位点,使用Sequenom MassArray技术,对我国分离的380株Xv血清型的菌株(河南[177株],甘肃[125株],安徽[78株])进行SNP分型。其中包括群1的4个SNP,群2的12个SNP,群3的2个SNP。18个SNP位点将380株菌分为5个SNP型别(SNP genotyping, SG)。SG1包括所有未分型的菌株。SG2和SG5分别对应基因组群1和群3。SG3和SG4对应基因组群2,因为在群2特有的12个SNP位点中有1个位点(SNP14)将群2分为2个SG。分型结果显示,SG2和SG5分别是河南省和安徽省的优势SG型,而SG3和SG4是甘肃省的优势SG型。同时SG2是我国的优势SG型别。除了本地优势SG型外,我们还发现SG2型在其他两个省份广泛传播,说明在一个地区内还存在地域间传播的菌株。 对携带SRL和Tn7耐药岛的50株ST91、1株ST109和1株ST142菌株基因组中2个耐药岛的编码基因及核酸序列,与参考菌株2002017及YSH6000比对后发现,9株ST91菌株的SRL耐药岛发生了插入或缺失。其中,7株缺失了编码四环素耐药蛋白的tet基因；1株缺失了编码β-内酰胺酶的oxa-1和编码氯霉素乙酰转移酶的cat基因；1株在SRL岛上获得了1个编码广谱p-内酰胺酶的bla TEM-1基因。所有50株ST91、1株ST109和1株ST142菌株携带的Tn7岛的核酸序列和编码基因与参考菌株相比未发现差异。说明我国ST91菌株的SRL岛上发生了基因的插入和缺失,而Tn7岛较为保守。另外,处于进化早期的家系III中的1株ST18菌株虽然没有获得完整的耐药岛,但携带岛上的3个耐药基因,而家系Ⅲ中的其他3株2a血清型的ST18菌株未获得2个岛。提示在ST91成为优势序列型之前,ST18序列型可能在我国已经广泛存在,而且在获得耐药岛的过程中发挥重要作用。另外1株分离自20世纪80年代的ST16序列型的菌株,虽然没有携带SRL和Tn7耐药岛,但携带YSH6000上的fec转铁基因簇。其基因序列和分离自上世纪60年代的日本菌株YSH6000的序列完全一致。说明fec基因簇在ST91成为中国优势序列型及Xv新血清型流行之前,就已经存在了。 本研究初步建立了我国福氏志贺菌的进化关系。揭示了ST91自上世纪90年代初期开始出现,在耐药选择压力下不断传播,最终成为我国福氏志贺菌的优势克隆群。Xv血清型的3个群分别在河南省、甘肃省和安徽省独立地获得了携带opt基因的质粒,分别完成了对O-抗原的磷酸乙醇胺修饰,成为了当地的优势型。同时在一个地区内还存在一定比例的地域间传播的菌株,与优势型一起造成了新血清型在当地的流行。因此,福氏志贺菌在我国的流行特征是本地优势型和区域间传播共同造成的。
【学位单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R378.25
【文章目录】：缩略词表
论文摘要
ABSTRACT
前言
材料与方法
结果
讨论
结论
参考文献
综述
参考文献
发表文章
附表
致谢
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本文编号：
2883772
