人微小纤溶酶原cDNA在毕赤酵母中的高效表达及活性检测

发布时间：2020-11-15 05:55

　　 【目的】人微小纤溶酶原是由261个氨基酸组成的肽链,位于人纤溶酶原第549～790位,含有纤溶酶原活性区域,被激活后具有纤溶活性,能够降解纤维蛋白。本文旨在优化人微小纤溶酶原cDNA在毕赤酵母中的表达条件。【方法】在NCBI中获取人微小纤溶酶原氨基酸序列,根据毕赤酵母密码子偏爱性原理,设计对应的DNA序列,然后进行人工合成。合成的基因序列经测序验证后酶切与表达载体pPICZαA连接形成重组表达质粒pPICZαA-mPlg,转入大肠杆菌JM109中扩增质粒,提取阳性菌落中的重组质粒,双酶切获得人微小纤溶酶原的表达单元,然后构建4拷贝(表达单元)pPICZαA-mPlg,单酶切线性化质粒。然后电转化导入感受态毕赤酵母SMD1168中,经表型筛选、PCR筛选阳性克隆,获得高表达人微小纤溶酶原工程菌。培养工程菌后,甲醇诱导工程菌细胞让人微小纤溶酶c DNA表达,用SDS-PAGE检查其分子量,发色底物法检测微小纤溶酶原活性,通过发酵条件优化提高人微小纤溶酶原的产量,用SP-Sepharose fast flow凝胶层析方法纯化目标蛋白。【结果】SDS-PAGE检测到符合人微小纤溶酶原分子量大小的蛋白条带,同时发色底物法检测出样品中含有纤溶活性,其水平达到90 U/mL。【结论】本文为后续进行大规模表达人微小纤溶酶原打下了基础。
【部分图文】：

使用发色底物法S-2403(pyroGlu-Phe-Lys-pNA·HCl)在波长为405 nm处检测发色底物S-2403的吸光度,从而达到检测人微小纤溶酶原的活性效果,将甲醇诱导4 d后的毕赤酵母菌液离心获得的上清液作为样品,长白山白眉蝮蛇蛇毒中提取的蛋白分解酶为标品,尿激酶作为人微小纤溶酶原激活剂,50 mM Tris-HCl pH7.4作为缓冲液,37 ℃在96孔板中反应。S-2403使用的浓度是0.3 mM,人微小纤溶酶原的检测终浓度在1～10 nM。1.2.6 甲醇添加比对人微小纤溶酶原表达的影响

pH对活性的影响

pPICZαA-4mPlg被BglⅡ和BamHⅠ双酶切后,1 %的琼脂糖凝胶电泳分析产物。一个人微小纤溶酶原的表达元件是2436 bp,4拷贝的人微小纤溶酶原为9744 bp。1～4号样品中,都有一条接近10 000 bp的4拷贝条带和3.6 kb的载体条带。实验结果与预测结果一致,表明质粒构建成功(图3)。图3 4拷贝重组蛋白表达载体构建
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本文编号：2884418